一、研究背景：每年，全球死于心血管疾病的人数大约有一千七百万之多，而冠状动脉粥样硬化性心脏病则占所有心血管疾病死亡率的50％以上。血管内皮功能与结构的损伤被认为是动脉粥样硬化发生与发腱的普遍机理。因此，寻找一种有效的方法来防治血管内皮损伤已成为目前研究的热点与焦点。 冠状动脉搭桥术后桥血管再狭窄的原因仍然是动脉粥样硬化病变的重复或延续。体内业已存在的危险因素从桥血管被连接到冠状动脉循环起，就开始了对桥血管内皮的作用，造成移植后桥血管内皮功能与结构的损伤，粥样斑块形成，继而出现桥血管再狭窄。 血管内皮细胞不仅仅是血液和组织之间的屏障，还具有其他多种功能，是一个具有高动力的自分泌和旁分泌器官。内皮受损、功能不全可导致冠状动脉张力调节功能受损，NO合成减少、ET分泌增加，内皮性生长因子释放增加，促使脂质向内膜下迁移、沉着，形成氧化型低密度脂蛋白，平滑肌细胞由分化状态变为去分化状态，从中层向内膜迁移，并在内膜下大量增殖和产生大量细胞外基质，导致内膜重塑，同时激活了血小板、促使血小板释放活性物质如TXA2、5-羟色胺等，从而产生内膜斑块，引起动脉管腔狭窄。 本实验利用小干扰RNA(smallinterferingRNAsiRNA)沉默CypD蛋白编码基因Ppif，下调内皮细胞中CypD蛋白的表达水平，同时利用基因克隆技术，建立CypD蛋白高表达的内皮细胞模型，研究在过度氧化应激条件下，CypD蛋的不同表达水平对血管内皮细胞抗氧化损伤能力及内皮细胞功能的影响，从而探讨CypD蛋白在内皮细胞功能障碍发生与发展中的作用，为防治冠状动脉粥样硬化性心脏病及外科术后桥血管再狭窄开辟新的思路。 二、研究目的: 1.建立内皮细胞氧化损伤凋亡模型。 2.观察凋亡模型中内皮细胞CypD蛋白及其编码基因Ppif表达程度的变化与内皮细胞凋亡的关系。 3.建立CypD蛋白缺陷型内皮细胞模型，在过度氧化应激条件下，比较CypD蛋白缺陷型内皮细胞与正常内皮细胞抗损伤能力的差异及两组内皮细胞功能的变化。 4.建立CypD蛋白高表达内皮细胞模型，在过度氧化应激条件下，比较CypD蛋白高表达内皮细胞与正常内皮细胞抗损伤能力的差异。 三、实验对象和方法: 1.实验细胞： 在37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中，用10％FCS的高糖型DMEM培养从武汉大学典藏中心购买的人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞。 2.建立内皮细胞氧化损伤凋亡模型： 将细胞分为A、B、C、D四组，每组重复3次。其中A、B、C为实验组，分别用含100uM、300uM和500uMH2O2处理ECV304细胞，于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中分别培养0min、30min、60min、90min和120min，换普通含10％FCS的高糖型DMEM培养基继续培养24h，D组为空白对照组，用不含H2O2的PBS液处理细胞，方法同上。 3.建立CypD缺陷型细胞： Ppif基因的siRNA由上海吉玛生物公司合成，其双链的基因序列为：Sence5—GCCGCUUUCCUGACGAGAATT—3’，Anti—sence5’—UUCUCGUCAGGAAAGCGGCTT—3’。将ECV304细胞按1×105个/孔接种于6孔板中培养24h，待细胞生长致融合70％时，用Lipofectamine2000按其说明上推荐的步骤，将siRNA转染进ECV304细胞，6h后用荧光显微镜和流式仪进行转染率的检测，并更换为普通培养基继续培养12h、24h、48h、72h。 4、建立CypD高表达型细胞： 合成Ppif基因的cDNA，并与载体pCDNA6/myc—HisB相连，生成Ppif质粒，通过脂质体Lipofectamine2000将质粒转入细胞，建立CypD蛋白高表达内皮细胞模型。 5.实验分组： 按CypD蛋白是否正常分为CypD缺陷型细胞组、CypD蛋白高表达细胞组和正常细胞组，每组3个以上样本。三组细胞均用凋亡模型浓度的H2O2处理120min或90min后，更换普通培养基再培养12h或24h，然后进行后续检测。 6.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。 7.Westernblot检测： 提取各组细胞样本的总蛋白，westernblot检测样本中CypD蛋白的相对表达水平。 8.实时荧光定量RT—PCR检测(q—RT—PCR)： 提取各组细胞样本的总RNA，反转录获得cDNA进行real—timePCR，分析各组细胞的Ppif基因的相对表达水平。 9.NO检测： 按照NO检测试剂盒说明书操作，在540nm检测吸光度OD值，根据公式计算NO含量。 10.电镜观察各组细胞超微结构的变化。 11.统计学处理： 计量资料以x±s表示，采用SPSS13.0软件进行重复测量数据的方差分析、双变量相关分析以及均数检验，检验水准取α=0.05。 四、实验结果: 1.内皮细胞凋亡模型组中的凋亡率、NO及CypD蛋白、Ppif基因相对表达量的变化： 重复测量数据方差分析示A、B、D三组间细胞凋亡率的差异无统计学意义(P>0.05)，但C组与A、B、D组的差异均有统计学意义(P=0.001)，均数检验示C组内各时间点的差异也有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析示C组凋亡率与H2O2作用时间呈显著正相关(相关系数为0.982，P<0.001)。 C组与D组细胞培养液中总一氧化氮的量分别为(8.46±0.77)μM和(21.28±1.94)μM，两独立样本T检验的结果表明差异有显著的统计学意义，D组的一氧化氮分泌总量明显比C组的要高，P<0.001。 正常ECV304细胞中CypD蛋白的分子量约为17KD。在C组中，随着氧化应激时间延长，CypD蛋白和ppif基因表达量也逐渐增加。30min、60min、90min和120min时间点的ppif基因表达量分别为0min的2.19倍、2.48倍、2.36倍和1.64倍(P<0.05)。 2.CypD缺陷型细胞凋亡率、NO及CypD蛋白、Ppif基因相对表达量的变化： 流式检测siRNA的瞬时转染率为(97.96±0.31)％。 Q—RT—PCR结果表明，Ppif的沉默效率在转染后的第48h最高，下调达11倍。 siRNA转染后westernblot检测结果显示，CypD蛋白表达水平随转染时间延长而逐渐减弱。 CypD缺陷型细胞组与正常细胞组的凋亡率分别为(32.51±6.6)％和(52.57±5.84)％，差异有统计学意义(P=0.001)。 CypD缺陷型细胞组与正常细胞组细胞培养液中总一氧化氮的量分别为(24.06±3)μM和(13.03±3.55)μM，差异有显著的统计学意义，P=0.015。 3.CypD高表达细胞凋亡率及CypD蛋白、Ppif基因相对表达量的变化： Q—RT—PCR结果表明，Ppif的表达在转染后的第24h最高，上调达274倍。 Ppif质粒转染细胞后westernblot检测结果显示，CypD蛋白表达水平随转染时间延长而逐渐升高，在转染后第48h达最高峰。 CypD高表达型细胞组与正常细胞组的凋亡率分别为(24.24±3.08)％和(7.7±0.68)％，差异有显著的统计学意义(P<0.001)。 4.细胞超微结构的变化： 透射电镜观察，PBS对照组以正常细胞为主，很少见凋亡；凋亡模型组细胞出现明显凋亡样改变，凋亡细胞很多，细胞微绒毛减少，大多数细胞核碎裂，可见典型核染色质浓集，分布于核膜周边，线粒体高度肿胀，细胞器高度破坏并出现较多空泡，部分仅见细胞轮廓；而CypD缺陷型细胞组中，细胞凋亡数量明显较凋亡模型组减少，形态改变也较轻，多为早期凋亡特征，线粒体肿胀成球型，许多细胞膜仍正常。 五、结论: 1.证实了在氧化应激条件下，CypD蛋白是ROS诱导增多的，引起线粒体损害、进而引起内皮细胞凋亡的一个关键的损伤性蛋白。 2.改进了内皮细胞氧化应激凋亡模型。模型中，即使去除了氧化应激的因素，细胞凋亡反应仍在继续，使模型的生理模拟性和特异性更高。 3.成功合成了Ppif基因的siRNA，特异、高效的沉默了内皮细胞线粒体Ppif基因的表达。(siRNA序列为Sense：5’—GCCGCUUUCCUGACGAGAATT—3’；Anti—sense：5—UUCUCGUCAGGAAAGCGGCTT—3’) 4.成功克隆了Ppif基因，合成Ppif质粒，建立了高表达CypD蛋白的内皮细胞模型。