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背景与目的复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是妇产科常见的异常妊娠疾病,对患者及家庭造成严重的健康影响及情感创伤。育龄夫妇发生连续两次及以上自然流产的概率约2-5%,且在年龄≥35岁女性中发生比例更高。RSA的病因复杂多样,主要包括遗传因素、解剖异常、精子质量异常、内分泌紊乱、感染、免疫功能异常、血栓形成倾向、全身性的疾病以及环境因素。但据估计约一半的RSA夫妇未发现明确的致病因素。正常孕期胎儿滋养细胞侵入母体子宫血管,母血释放入绒毛间隙为胎儿提供直接营养,且直接暴露的滋养细胞不引发母体同种异体免疫排斥反应。子宫免疫应答反应允许胎盘得到母体营养供给同时抑制其过度植入,破坏滋养细胞与子宫组织的这种平衡状态将导致一系列的临床问题。随着对不明原因复发性流产的深入研究,学者发现母胎接触面免疫异常可能导致流产的发生,其中广泛存在于子宫蜕膜的自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)基因及其配体-人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)基因因其独特的组合及功能的多样性被认为在妊娠免疫排斥反应中发挥重要作用。最近几十年,越来越多的文献报道KIR基因家族和HLA-C配体与RSA发生相关,但意见迥异。本研究旨在对中国河南汉族不明原因复发性流产患者及正常经产妇对照的KIR及HLA-C基因多态性进行研究和对比分析,探索其与RSA发生的相关性,为RSA预防提供遗传学理论依据,为评估患者再发风险、指导治疗及再次生育奠定基础。资料与方法1.资料来源:本研究收集了2015年9月至2016年9月期间就诊于郑州大学人民医院的连续两次及以上在28周之前自然流产,未生育过孩子的患病夫妇资料。所有RSA夫妇行染色体核型分析及病因检查,排除遗传因素、解剖因素、感染因素、免疫因素、精子质量、内分泌紊乱、血液高凝及全身性疾病引起的流产发生。对所有可获得的自然流产胚胎组织行拷贝数变异(copy number variants,CNV)检测排除染色体异常引起的流产。110名RSA女性(平均年龄28.3岁,年龄19-39岁)符合不明原因复发性流产条件被招募入组。2015年11月至2016年9月于河南省红十字血液中心收集至少生育过一个健康孩子且没有自然流产史的健康经产妇105名(平均年龄26.2岁,年龄18-39岁)作为对照组。所有参与成员已签署知情同意。2.实验方法:留取外周血样5ml装入含乙二胺四乙酸(ethylenedimine tetra-acetic aid,EDTA)抗凝管,4℃冰箱保存。采用血液基因组提取试剂盒(天根)提取所有参与成员的外周血全基因组DNA,使用NanoDrop 2000对样品DNA进行定量及质量控制。采用Invitrogen公司的KIR基因分型试剂盒(KIR Genotyping SSP Kit)运用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)方法对KIR基因分型进行检测。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶150V电泳30分钟。紫外灯下观察跑胶结果并拍照。HLA-C基因根据第二外显子77和80位氨基酸不同分为C1、C2两型,分型用设计引物PCR扩增方法。3.统计学方法:应用SPSS(Statistic Package for Social Science)17版本软件所有KIR与HLA-C基因数据进行统计分析。P<0.05存在统计学差异。结果1.KIR基因频率在病例组和对照组的分布我们对病例组(110例)和对照组(105例)样本进行了16种KIR基因的分型。结果显示:假性基因KIR2DP1存在于所有正常对照者中(105/105),在病例组中携带率为99.1%(109/110)。在两组中,抑制型基因的频率均相对较高。在所有的抑制型KIR基因中,KIR2DL1的频率最高,在病例组和对照组中分别为99.1%(109/110)和100%(105/105)。抑制型KIR2DL3和3DL1的频率较高,在两组中携带率均大于91.8%。除了KIR2DS4,剩余激动型KIR基因频率均小于40%。激动型KIR2DS2的频率最低,病例组和对照组中分别为18.2%和16.2%。各KIR基因频率在两组之间对比无显著性差异,且两组抑制型和激动型基因携带数相比无显著性差异。2.KIR基因型频率在病例组和对照组的分布在病例组和对照组中共19和17种基因型分别被检测到。KIR基因型频率的分布在两组中相似。在所有参与者中最常见的基因型是KIRAA(AA1,由3DL1,2DL1,2DL3,2DS4,2DL4,3DL2,3DL3,2DP1和3DP1组成),占病例组的50.9%,占对照组的53.3%。两组中KIRAB基因型频率分别为40.0%和42.9%。KIRBB基因型在病例组中占9.1%,在对照组中占3.8%(P=0.127)。KIR基因型可以被分为着丝粒区和端粒区基因型:Cen-A(2DL3和2DL1),Tel-A(3DL1和2DS4),Cen-B(2DS2,2DL2,2DL5B和2DS3),和Tel-B(3DS1,2DL5A,2DS5和2DS1)。两组着丝粒区和端粒区基因型比较未发现显著性差异。3.HLA-C基因及基因型频率在病例组和对照组的分布HLA-C1及C2的频率及HLA-C基因型(HLA-C1C1,C1C2或C2C2)频率在病例组和对照组中分布相似,无显著性差异。按KIR AA、KIRAB及KIR BB基因型进行分组,各组中携带HLA-C各基因型的频率相比无显著性差异(表3)。病例组中HLA-C2C2基因型的患者同时携带KIR2DS1基因的频率高于对照组,但无统计学意义(5/11 vs.0/7,45.5%vs.0.0%,P=0.101)。4.流产次数与基因及基因型频率分布的关系根据流产的次数把实验组分为了两个亚组[流产2次病例组(n=70)和多次流产病例组(即流产≥3次病例组,n=40)。多次流产病例组KIR3DL1基因频率相比对照组明显降低(33/40 vs.101/105,82.5%vs.96.2%,P=0,015;OR,0.187;CI,0.051-0.678)。激动型KIR基因及与HLA-C结合的抑制型基因2DL1,2DL2和2DL3频率在多次流产病例组和对照组之间无差异。多次流产病例组相比对照组,KIRBB的频率增加(5/40 vs.4/105,12.5%vs.3.8%,P=0.025;OR,3.617;CI,1.107-11.818)。同时,Tel-BB基因型频率相比对照组增加(P=0.025),而着丝粒区基因型对比无差异。相比对照组,多次流产病例组按KIR AA、KIRAB及KIR BB基因型进行分组,各组中携带HLA-C各基因型的频率相比无显著性差异。多次流产病例组中HLA-C2C2基因型与KIR2DS1基因共存的频率显著高于对照组,有统计学意义(3/5 vs.0/7,60.0%vs.0.0%,P=0.045)。结论1.复发性流产女性患者抑制型KIR基因频率降低。2.复发性流产女性患者活化型KIR及HLA-C基因组合频率增加。3.复发性流产≥3次的患者与遗传因素尤其是KIR和HLA-C基因相互作用相关性更大。