【摘 要】
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目的观察正常氧及缺氧骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）的形态、表型、凋亡及自噬水平;探究7磷酸肌醇（Inositol Pyrophosphates,IP7）对缺氧诱导的BM-MSCs的自噬和凋亡的潜在作用,并进一步对相关信号通路进行初步研究及分析。方法在无菌环境下分离健康的清洁级成年C57BL/6小鼠股骨、胫骨,体外分离BM-M
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目的观察正常氧及缺氧骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）的形态、表型、凋亡及自噬水平;探究7磷酸肌醇（Inositol Pyrophosphates,IP7）对缺氧诱导的BM-MSCs的自噬和凋亡的潜在作用,并进一步对相关信号通路进行初步研究及分析。方法在无菌环境下分离健康的清洁级成年C57BL/6小鼠股骨、胫骨,体外分离BM-MSCs,并培养至第3代。采用流式细胞术测定BM-MSCs细胞表型,给予BM-MSCs正常氧及缺氧（6h、12h、24h）处理。另外,给予N6-（对硝基苄基）嘌呤（TNP）来抑制IP7的生成。进一步通过TUNEL染色标记BM-MSCs凋亡的状况。同时,我们通过m RFP-GFP-LC3双荧光蛋白表达载体在显微镜下观察自噬情况。Western Blot方法检测自噬蛋白（LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、P62）,凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-m TOR、m TOR、p-p70S6 K、p70S6 K,p-S6、S6的表达。结果显微镜下可观察到BM-MSCs呈典型纤维样梭形。BM-MSCs表型鉴定呈CD90、CD44、CD29阳性,CD34、CD45、Vimentin,SMA,c-kit阴性,证明鉴定细胞为公认MSC免疫表型,非造血干细胞或成纤维细胞;进一步,我们发现,与正常氧组BM-MSCs相比,缺氧组BM-MSCs的自噬体增多LC3-2/LC3-1、Beclin-1的表达水平增加,而P62蛋白表达水平呈下降趋势（P<0.05）,提示缺氧提升BM-MSCs的自噬水平（P<0.05）;缺氧组BM-MSCs的TUNEL阳性细胞数增多（P<0.05）,并且凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达也增加,提示缺氧增加细胞凋亡;与正常氧组BM-MSCs比较,缺氧组BM-MSCs的IP7生成增加（P<0.05）;缺氧组BM-MSCs信号通路相关蛋白p-Akt、p-m TOR、p-p70S6K、p-S6表达则减少（P<0.05）。相反,TNP组BM-MSCs的IP7生成减少（P<0.05）;与缺氧组BM-MSCs比较,TNP使BM-MSCs的自噬体减少;另外,BM-MSCs的LC3-2/LC3-1、Beclin 1的表达下降,P62蛋白表达上升（P<0.05）,提示TNP使缺氧BM-MSCs的自噬水平下降;同时,TNP组BM-MSCs的TUNEL阳性细胞数较缺氧组减少（P<0.05）,提示TNP下调BM-MSCs凋亡;与缺氧组BM-MSCs比较,TNP组BM-MSCs信号通路相关蛋白p-Akt、p-m TOR、p-p70S6K、p-S6表达增加（P<0.05）。结论缺氧可能通过IP7介导的Akt/m TOR信号通路增加BM-MSCs的自噬和凋亡,这可能为心肌梗死（MI）的治疗提供新的潜在靶点。
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