重组DNA技术已运用到丝状真菌的研究中,以期获得高产菌株。然而,缺乏有效的转化体系一直制约着丝状真菌基因工程的研究。以获得构建丝状真菌转化系统的筛选标记为目的,从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌,拟从中筛选到抗性基因,为进一步研究农杆菌转化丝状真菌奠定基础。该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2.7 g·L-1。采用常规生理生化鉴定方法,并结合16S rDNA序列分析法对该菌进行鉴定。结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)序列相似性为99.3%,在细菌分类学上属于肠杆菌。将它命名为Enterobacter sp. PPT。采用电击转化方法将双元载体导入根癌农杆菌LBA4404,研究了不同条件对转化率的影响。实验结果表明:细胞浓度为4×108、当电场强度为11 kV·cm-1时,转化率达到最高值,为每微克DNA含9.8×103个转化子;在细胞的OD600约为1.0时进行电转化,转化率可达到最高,为每微克DNA含9.54×103个转化子;在一定的细胞浓度范围内,电击转化率与细菌浓度密切相关,转化率随着细菌浓度的上升而上升;质粒大小与电击转化效率之间没有明确的关系。含pCAMBIA3300的根癌农杆菌与丝状真菌共培养转化,在含有PPT的平板上筛选到转化子。PCR扩增转化子的染色体,初步证明Bar基因转入丝状真菌中。研究表明:以Bar基因为转化选择标记和以PPT为选择压是可行的,建立了以Bar基因为抗性选择标记的农杆菌介导丝状真菌的遗传转化平台,为今后丝状真菌的转化奠定了基础。在上述根癌农杆菌介导丝状真菌转化的基础上,首先尝试了将产甘油假丝酵母的产甘油关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glycerol 3-phosphate dehydro-genase GPD)与3-磷酸甘油酯酶基因(glycerol 3-phosphatase GPP)转化到丝状真菌中。因此,分别构建了上下游依次为CaMV35S启动子、GPD基因片断或GPP基因片断和Tnos终止子的的重组表达载体质粒pCAM3300-h-D和pCAM-3300-h-P,在启动子上游含有供选择用的PPT和潮霉素B抗性基因。用含有该重组质粒的根癌农杆菌与几种丝状真菌的菌丝和孢子分别共培养,在含乙酰丁香酮(AS)的条件下,可分别筛选PPT和潮霉素B的抗性转化子。通过PCR扩增证明质粒转入丝状真菌中。将黑曲霉和粗糙脉孢菌的转化子与相应的出发菌株分别进行发酵培养,观察GPD及GPP基因的转入对丝状真菌产甘油的影响。结果发现GPD及GPP基因对丝状真菌产甘油能力的有一定的影响。