本文从以下几方面进行论述：　　第一部分 非梗阻性无精症患者睾丸显微取精找到和未找到精子组间睾丸来源的miRNA差异表达的测序与鉴定　　目的：miRNA是长19-25个核苷酸的小分子非编码单链RNA，与靶mRNA的3非编码区(3UTR)结合，使靶mRNA翻译受到抑制或直接降解而发挥转录后调节作用。并且，miRNA能够稳定地存在于细胞之外的体液中，具有作为疾病分子生物学标志物许多特点，已在多种疾病诊断和预后中表现出独特的应用价值。此外，miRNA与男性生殖也密切相关，在精子发生中发挥着重要的表观遗传学作用，是男性不育症的原因之一。比较非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia，NOA）患者睾丸显微取精（micro-TESE）找到和未找到精子组间睾丸来源的miRNA表达，找到差异表达的miRNA，可作为判断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的预判指标，并有望作为micro-TESE手术能否找到精子的生物学标志物，可减轻一部分病人不必要的身体上的伤害、心理上和经济上的负担。　　方法：收集通过micro-TESE找到和未找到精子的睾丸组织标本。Trizol法提取各标本的总RNA，质检合格后加3’和5’端接头收获带有接头的单链RNA进行反转录，对反转录产物进行PCR扩增并切胶回收建立small-seq cDNA文库，采用第二代高通量测序技术测序。使用NCBI/Primer-BLAST在线设计Divergent Primer和测序剩余的RNA对测序结果进行RT-qPCR验证。　　结果：相较于找到精子组，未找到精子组中有13个miRNA显著升高，167个miRNA显著降低，其中近一半分布在19号染色体上。此外，45个睾丸表达的miRNA，6个睾丸miRNA家族被首次发现。　　结论：NOA患者中找到和未找到精子组间睾丸组织的miRNA有显著差异。这些差异显著的miRNA与NOA患者能否找到精子密切相关，有望作为NOA患者能否找到精子无创诊断的生物学标志物。　　第二部分 人睾丸组织来源的miRNA-34c-5p与Prnd基因靶向关系的验证　　目的：本课题组前期实验研究发现，NOA患者未找到精子组（unsuccessful sperm-retrival group,USRG）和找到精子组（successful sperm-retrival group,，SSRG）中hsa-miR-34c-5p表达明显下调，通过生物信息学方法预测hsa-miR-34c-5p靶基因有2851个，利用PCR方法对10个hsa-miR-34c-5p可能靶基因Dll1，Gsg1，Rsbn1，Smad7,Prnd,Hnf4a,Mycn,Foxp1,Foxg1,Bcl2在NOA患者USRG和SSRG以及正常睾丸组织中表达情况进行初步分析，结果发现，Prnd基因在USRG中表达要明显高于SSRG和正常睾丸组织组，与hsa-miR-34c-5p表达呈负性相关，提示hsa-miR-34c-5p对Prnd的表达具有调控作用，Prnd可能是hsa-miR-34c-5p的潜在靶基因，但是不能确定二者的直接关系。为了研究hsa-miR-34c-5p与Prnd之间的靶向关系，本部分实验通过构建克隆有目的基因片段的双荧光素酶报告基因载体，验证二者的相互关系，为后续进一步探讨hsa-miR-34c-5p在NOA发生、发展过程中可能机制提供实验基础。　　方法：利用miRNA靶基因预测工具TargetScanHuman7.1，找到hsa-miR-34c-5p与Prnd基因3‘-UTR区域的结合序列，据此设计合成Prnd3‘-UTR序列和突变后的序列Prnd3‘-mut-UTR，然后，将合成的目的基因片段分别克隆到双荧光素酶报告基因载体pmir GLO中，得到野生型（pmir GLO-Prnd）和突变型载体（pmir GLO-mut-Prnd）。随后，对得到的两种重组载体进行PCR电泳和基因测序验证，鉴定载体是否构建成功。载体构建成功以后，再将两种重组载体以及空载体pmir GLO分别与miR-34c-5p的模拟物或miR-34c-5p的阴性对照分别转染293T细胞，转染成功后培养24-72小时，利用双荧光素酶检测系统检测6组细胞的荧光活性。　　结果：转染有野生型载体pmir GLO-Prnd的实验中，miR-34c-5p mimics组中的荧光活性明显低于NC组，且具有统计学差异（P＜0.05）。而转染有突变型载体pmir GLO-mut-Prnd中，荧光酶的活性与只转染了pmir GLO载体组结果类似，即mimics组与NC组之间荧光酶的活性无显著统计学差异（P＞0.05）。　　结论：Prnd基因是miR-34c-5p的靶基因，且miR-34c-5p结合在Prnd基因的3‘-UTR区域，在转录后水平对Prnd基因有抑制作用。　　第三部分 NOA患者睾丸micro-TESE找到和未找到精子组间睾丸来源的差异表达的miRNA在精浆中的表达　　目的:寻找在NOA患者USRG相较于SSRG显著下调或上调的miRNA，作为预判NOA患者显微取精结果的分子标记物，避免一部分找不到精子的NOA患者遭受不必要的手术伤害。　　方法：在测序所得的具有显著差异的miRNA中，根据reads＞200，foldchange＞2的筛选标准，筛选出15个miRNA进行RT-qPCR验证，然后将这15个miRNA与文献中报道的来源于正常成年男性睾丸或附睾的miRNA进行比对，筛选出3个miRNA（hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-29b-3p），利用RT-qPCR方法在正常男性和NOA患者精浆中对这三个miRNA表达进行检测　　结果：筛选出3个miRNA（hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-29b-3p）是正常成年男性睾丸或附睾来源的精浆miRNA，其中，hsa-miR-22-3p在正常人和NOA患者精浆中表达有显著差异（P＜0.05）。　　结论：精浆中这3个miRNA（hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-29b-3p）单个或者组合有望作为预判NOA患者显微取精能否找到精子的预判指标。