星状病毒（Astrovirus,AstV）属于星状病毒科,其中包括哺乳动物星状病毒（Mamastastrovirus,MastV）属和禽星状病毒（Avastrovirus,AAstV）属。星状病毒是引起幼龄动物腹泻的主要病原之一,且其感染禽类可造成严重的脏器损伤,甚至死亡。自2017年以来,我国多地鹅场陆续发生雏鹅大量死亡,发病雏鹅以内脏和关节型痛风为典型临床特征,剖检可见内脏表面和关节腔存在着大量白色尿酸盐沉积。因发病雏鹅死亡率为20%-30%,最高可达50%,大大阻碍了养鹅业健康发展。基于此,本研究对造成此次雏鹅痛风流行的致病病原进行了分离鉴定,并对有关病原的检测和防控方面作了初步的探讨,研究结果为有效控制雏鹅痛风病的流行与发展提供了重要的理论基础和实践依据。1 鹅星状病毒的分离与鉴定剖检患病雏鹅并通过细菌学检查排除细菌感染后,采集病料接种12日龄鹅胚进行病毒分离,并采用PCR方法和构建进化树来开展病毒分离株的鉴定工作。本研究通过鹅胚接种成功分离得到一株鹅源星状病毒,命名为AstV/Goose/CHN/2019/AHMG（简称AHMG）。在以ORF2氨基酸序列建立的遗传进化树中,AHMG株与其它鹅星状病毒毒株同处一个进化分支,且氨基酸同源性均大于98%。鹅胚收获病毒液经颈部皮下注射感染1日龄健康雏鹅,雏鹅表现出腹泻、厌食、精神沉郁等与自然感染相一致的临床症状,且发病率为27%,死亡率为7%。剖检可见内脏和关节有典型的白色尿酸盐沉积现象。镜检显示肝细胞脂肪变性、肾小管上皮细胞脱落。以上结果表明,鹅源星状病毒是造成此次雏鹅痛风流行的病原。2 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR检测方法的建立根据鹅星状病毒ORF1b区域设计一对特异性引物,采用PCR方法扩增长度为110 bp的目的片段,构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR标准品质粒,测得浓度为2.3×1010拷贝/μL。对引物浓度等相关条件优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,加入1.0μL浓度为20μmol/L的引物时,该反应有较好的扩增效率,标准曲线Ct值与标准质粒浓度呈现良好线性关系,其中相关系数R~2为0.990,扩增效率为104.5%。选用鹅细小病毒、禽流感病毒等其它常见的鹅致病性病毒进行特异性试验,显示只有以鹅星状病毒为底物模板的反应出现高而平滑的扩增曲线。本研究建立的检测方法的敏感性是普通PCR的1000倍。且组间和组内重复性试验的变异系数均小于1.00%。临床样品检测结果显示,所建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的阳性检出率为100%,而普通RT-PCR方法的阳性检出率为85%。以上结果表明,本试验建立的检测鹅新型病毒性痛风病原的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有重复性好、特异性强、灵敏度高的特点,可用于鹅星状病毒的病原检测和定量分析。3 鹅星状病毒衣壳纤突蛋白的表达根据鹅星状病毒ORF2 C端区域设计一对特异性引物,以鹅星状病毒AHMG株为模板,扩增长度为723 bp的目的片段,构建重组衣壳纤突蛋白表达载体pET32a（+）-S,并转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行AHMG株衣壳纤突蛋白的原核表达。研究发现当ⅠPTG的终浓度为1.5mmol/L、诱导6h时,蛋白表达量最高。用优化后的诱导条件培养菌体,分别取诱导后的菌体上清和沉淀进行SDS-PAGE,结果显示重组蛋白为包涵体蛋白。纯化重组蛋白,采用湿转法并以His标签蛋白作为一抗对重组纤突蛋白进行Western Blot鉴定,发现在蛋白相对分子量约52 kDa处出现目的条带,且条带单一无杂带,与预期结果相符。以上结果表明,本试验成功表达了 AHMG株衣壳纤突蛋白,结果将有助于推进今后鹅星状病毒的血清学检测方法的建立。综上所述,通过鹅胚接种成功分离得到一株鹅源星状病毒,结合动物回归试验,证明鹅源星状病毒是导致雏鹅发生新型病毒性痛风的原因;成功建立了鹅源星状病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法;并利用大肠杆菌原核表达系统成功表达出了鹅星状病毒衣壳纤突蛋白。上述研究结果为快速诊断雏鹅新型病毒性痛风提供了有效手段,也为进一步深入研究该病毒的生物学特性和致病机制奠定了理论基础。