日本囊对虾早期胚胎转录组的测序与分析及其POU3基因的克隆与表达研究

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日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus),又名日本对虾,是国内外主要海水养殖对虾品种之一,具有较强抗病力,受到养殖业者的青睐。然而目前日本囊对虾的基因组序列信息还比较匮乏,分子遗传基础也很薄弱,遗传育种工作也属于起步阶段,进而影响到与之相关的功能基因的开发和分子育种的实践。因此,本研究拟利用新一代高通量Illumina测序技术,对日本囊对虾早期胚胎(原肠胚时期)进行转录组测序,通过对高质量序列的拼接组装以及功能基因的注释和分类,发掘与生长、繁殖、代谢和抗病等相关性状的候选基因,从而为后续研究对虾功能基因和分子育种实践提供有价值信息。同时,利用RT-PCR技术,对日本囊对虾转录因子Mj-POU3进行基因克隆和特异性表达分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1-Ptctp-POU3,为进一步探究其在细胞中的表达和作用奠定了基础。应用Illumina高通量测序技术,对日本囊对虾早期胚胎进行转录组测序获得如下结果:(1)共获得108,320,302条高质量序列,通过序列拼接得到67183个转录本(Transcripts)和46661个单基因簇(Unigenes),Transcripts和Unigenes的平均长度分别为1216bp和910bp。对日本囊对虾拼接得到的Unigenes与NT、NR、SwissProt和PFAM等公共数据库比对,通过GO注释结果对基因进行分类,通过KEGG注释来揭示基因间的联系及其参与的体内生化代谢网络。(2)已从注释的基因中鉴别出52个调控日本囊对虾早期胚胎发育的生长因子及其受体,找到了MAPK和TGF-β信号通路中与生长相关的11个基因;找到大量与生长、发育、繁殖、免疫等生产相关的候选基因,为后续开展功能基因研究和分子育种实践提供有价值的信息。Mj-POU3是转录因子POU基因家族的重要成员,可与DNA结合并在生物个体发育的各个阶段发挥重要的调控作用。本文利用RT-PCR技术成功克隆得到日本囊对虾POU3基因的完整编码区,全长1194bp,编码397个氨基酸。蛋白质功能域分析表明,Mj-POU3含有两个保守的功能域POU-S(特异性结构域)和POU-H(同源结构域)。氨基酸序列比对发现,该基因与无脊椎动物的同源性达到62%以上,与脊椎动物的同源性也达到55%左右,说明Mj-POU3氨基酸序列十分保守。相较于脊椎动物,与无脊椎动物的同源性更高。本文以日本囊对虾的基因组DNA为模板,扩增得到同样长度(1194bp)的Mj-POU3基因,经测序检测得知是同一条序列,这表明日本囊对虾POU3基因没有内含子。本文利用半定量PCR技术分析了日本囊对虾POU3基因在胚胎、肌肉和卵巢中的表达情况,发现Mj-POU3在卵巢中表达量最高,在胚胎中的表达量次之,在肌肉中则完全没有表达。所以推测Mj-POU3可能参与对虾卵母细胞的发生以及早期胚胎发育多能性的维持。
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