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视网膜新生血管(retinal neovasculanzation,RNV)是多种眼底疾病的共同病理特征,氧化应激损伤是RNV发生发展的主要诱发因素之一,其具体机制可能与视网膜的特殊结构组织密切相关。视网膜星形细胞(retinal astrocytes,RACs)是位于视网膜神经上皮层的胶质细胞。RACs与微血管内皮细胞有着密切的解剖关系。RACs的分泌功能尤其是关于外泌体的研究近年来受到广泛关注,可能为RACs介导的内皮细胞调节提供潜在的线索。目的:本研究旨在初步探讨氧化应激下RACs产生的外泌体参与内皮功能调控的机制。方法:1.氧化应激损伤对RACs的影响(1)用细胞技术试剂盒(cell counting kit 8,CCK8)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验验证叔丁基过氧化氢(t-butylhydroperoxide,t BHP)损伤RACs后的细胞生存率,确定造模浓度。(2)用流式细胞术和annexin V–FITC染色检测t BHP处理后RACs的凋亡水平。(3)为了进一步证实这种损伤是由氧化应激引起的,我们检测了谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度和细胞脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,这两种物质分别可以评估抗氧化产物和膜脂过氧化水平。并采用流式细胞术检测细胞中DCHA-DA染色情况以确定细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。(4)用Western blot,免疫荧光,电镜和共聚焦检测氧化应激损伤后RACs的凋亡和自噬水平。2.在共培养体系中,RACs的自噬水平对人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVECs)增殖、迁移和成管影响(1)用Western blot验证RACs自噬水平。分组为:对照组,t BHP处理组,t BHP+自噬抑制剂3MA(3-methyladenine)处理组,t BHP+DMSO处理组。(2)用划痕实验和成管实验检测不同处理对HUCECs增殖、迁移和成管的影响。分组为:ECGS(Endothelial cell growth factor)组,ECGS+control RACs共培养组,无ECGS组,无ECGS+t BHP处理RACs共培养组,无ECGS+t BHP+3MA处理RACs共培养组。(3)用Western blot和免疫荧光检测不同处理下HUVECs的增殖和迁移相关通路表达水平。3.提取RACs分泌的外泌体,并检测不同状态下RACs分泌的外泌体对HUVECs增殖、迁移和成管的影响(1)用超高速离心法提取RACs分泌的外泌体,通过Nanosight、电子显微镜扫描、共聚焦、western blot从浓度、粒子微径、形态、标记蛋白表达的方面来对所提取外泌体进行鉴定。(2)用Western blot检测不同处理对RACs自噬水平的影响,划痕实验和成管实验检测不同状态下RACs源性的外泌体对HUVECs增殖、迁移和成管的影响。(3)用Western blot和免疫荧光检测不同状态下RACs源性外泌体处理HUVECs后其增殖、迁移相关通路表达水平。结果:1.氧化应激损伤诱导RACs凋亡及自噬水平增高(1)CCK8和LDH结果显示,15和30u M t BHP处理RACs后,分别导致细胞生存率为75%和55%。而RACs的台盼蓝染色和明场图像则显示在t BHP处理后,染色阳性的细胞数目显著增高,细胞形态也有了显著变化(p<0.01)。(2)采用annexin-V FITC染色和流式细胞术检测低、高剂量t BHP处理后细胞凋亡情况,显示t BHP处理后细胞凋亡水平显著升高(p<0.01)。(3)t BHP处理后RACs细胞内MDA水平和GSH浓度的结果显示,MDA随着t BHP浓度的增高而增高,GSH则随药物浓度增高而降低。DCHA-DA染色和流式细胞术的结果则显示随着t BHP浓度增高细胞内ROS的水平显著上升(p<0.01)。(4)Western blot、tunel染色及免疫荧光的结果显示,随着t BHP处理浓度增高,RACs的凋亡通路相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase 3都显著增高,而自噬通路相关的m TOR、P62、LC3都也显著上升(p<0.01)。而共聚焦图像则显示自噬溶酶体在t BHP处理组的RACs细胞内明显增多,LC3β和LAMP1标记阳性。电镜扫描图像则表现出随着t BHP处理浓度增高,细胞内正常线粒体数量减少,同时自噬小体数量增多(p<0.01)。2.在共培养体系中,RACs的自噬水平增强可促进HUVECs增殖、迁移和成管(1)Western blot结果显示t BHP处理RACs显著增加其LC3的表达(p<0.01),同时降低P62的表达(p<0.05)。而在t BHP的基础上加用3MA后,自噬相关蛋白的表达被逆转(p<0.01)。(2)在共培养体系中,划痕和成管实验的结果显示,与正常的RACs共培养后,HUVECs的迁移和成管被抑制(p<0.05),而与t BHP处理的RACs共培养后,HUVECs的迁移和成管则被促进(p<0.01),在t BHP的基础上加上3MA处理RACs后,其对HUVECs迁移和成管的促进作用被逆转(p<0.05)。(3)在共培养体系中,正常的RACs高度抑制HUVEC中与增殖和迁移相关的通路,而自噬水平较高的RACs则增强了这些通路。Western blot结果和免疫荧光结果显示,与ECGS组相比,与正常RACs共培养可降低HUVECs中Src、FAK、Akt、m TOR的活性和cyclin D1、VE cadherin表达显著降低(p<0.05)。而与t BHP处理后的RACs共培养较无ECGS组明显增加了Src、FAK、Akt、m TOR的活性和cyclin D1和VE cadherin的表达(p<0.01)。此外,3MA可以阻断和t BHP处理的RAC共培养对HUVECs相关通路的影响(p<0.01)。3.氧化应激状态下RACs分泌的外泌体促进HUVECs增殖、迁移和成管(1)t BHP处理后的RAC共聚焦图像中,可以观察到被外泌体标记蛋白CD63和自噬标记蛋白LC3β共同标记的自噬内涵体。Nanosight和透射电子显微镜的结果显示,正常RACs、t BHP处理后的RACs、t BHP+3MA处理后的RACs产生的外泌体有所差异。正常RACs来源的外泌体比t BHP处理后RACs来源的外泌体体积更小,浓度更高。而t BHP基础上加用3MA可以进一步增大外泌体粒径,提高浓度。Western blot检测细胞和外泌体样品中标记物的结果显示,HSP70、TGS101、CD81和CD63在对照、t BHP和t BHP+3MA外泌体中的表达存在明显差异。(2)从正常和t BHP处理后的RACs中分离出的外泌体对HUVEC迁移和成管有不同的影响,而GW4869可以显著降低这种影响。Western blot结果表明GW4869不会影响t BHP诱导的RACs中LC3β/LC3α比率或p62表达。迁移和成管实验显示,正常RACs生成的外泌体可抑制ECGS诱导的HUVECs功能改善(p<0.05)。然而,氧化应激状态下RACs获得的外泌体可以显著促进HUVEC迁移和管形成(p<0.01)。GW4869抑制外泌体释放后,t BHP处理后RACs源性的外泌体对HUVECs的促进作用明显减弱(p<0.01)。(3)Western blot和免疫荧光结果显示,正常的RACs外泌体可抑制HUVECs与增殖和迁移相关的通路,而来自自噬水平较高的RACs的外泌体则增强了这些通路。与ECGS处理组相比,正常RACs来源的外泌体可降低HUVECs中Src、FAK、Akt、m TOR活性和cyclin D1和VE cadherin的表达。然而,与无ECGS处理组相比,t BHP处理后RACs外泌体可以明显提高HUVECs中cyclin D1和VE cadherin的表达和Src、FAK、Akt、m TOR活性。此外,GW4869可以阻断t BHP处理后RACs来源的外泌体对HUVECs增殖迁移相关通路的影响。结论:1.氧化应激损伤可诱导RACs凋亡和自噬水平增高。2.在共培养体系中,RACs自噬水平增强可促进HUVECs的迁移和成管及其相关通路活性,并且该促进作用可被自噬抑制剂3MA减弱。3.自噬内涵体可同时被自噬体标记蛋白LC3和外泌体标记物CD63标记。不同病理生理状态下RACs自噬水平改变,其分泌的外泌体在尺寸、分布和内容物上有不同。自噬体和外泌体合成相关联。4.氧化应激诱导自噬水平增高的RACs来源的外泌体可以促进HUVECs的迁移和成管及其相关通路,并且该促进作用可被外泌体抑制剂GW4869减弱。