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传统的生物活性肽制备技术开发主要是依据小分子多肽进入体内后可以直接被吸收的理论而进行,没有考虑对人体消化功能的利用,导致存在过度酶解的可能性,生产成本显著增加。如果考虑了人体的消化功能,那么在多肽制备技术开发中对酶解产物的活性检测就应当后移至体外模拟胃肠消化之后,这样就有可能不需要酶解到较小的分子,或者完全不需要酶解,也能获得理想的活性功能。人体的胃肠道消化酶具有独特的酶切位点和消化特性。胃蛋白酶是内肽酶,主要分解酸性氨基酸羧基端的肽键,尤其是羧基为芳香族氨基酸的肽键;胰蛋白酶特异性切割赖氨酸、精氨酸旁边的肽键;胰凝乳蛋白酶分解疏水性氨基酸残基及芳香族氨基酸相邻的肽键。核桃蛋白的氨基酸组成主要以疏水性氨基酸和酸性氨基酸为主,同时谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量较高,比较适合于胃肠道消化酶的酶解。因此,本文利用酶解评价新思路,以抗氧化和降血压活性为考核指标,对核桃蛋白通过酶解制备这两种活性多肽的必要性进行了深入系统的研究。研究内容及主要结论如下:(1)评价了核桃蛋白的氨基酸组成及营养学特性,并以多肽、游离氨基酸、ACE抑制活性,DPPH自由基清除活性以及分子量分布为评价指标,对核桃蛋白及其碱性蛋白酶酶解物的体外模拟胃肠消化效果进行了比较研究。结果表明:核桃蛋白氨基酸组成合理,必需氨基酸含量(26.98%)、功效比值预测值(1.55,1.58)和生物价预测值(87.96%)较高。核桃蛋白经过模拟消化后,消化液中多肽含量为21.66 mg/mL,高于酶解液的模拟胃肠消化液(19.84~21.16 mg/mL);游离氨基酸含量(8.09 mg/mL)和ACE抑制活性(44.85%)与酶解物的模拟胃肠消化液没有显著性差异(p>0.05);DPPH自由基清除活性(66.53%)高于酶解物的模拟胃肠消化液(36.38%~63.60%)。分子量分布结果显示,核桃蛋白及其酶解物经体外模拟消化后,均可被水解为<3000 Da的小分子量肽段。初步判断,利用碱性蛋白酶酶解制备高ACE抑制活性与DPPH自由基清除活性的核桃多肽是没有必要的,直接食用核桃蛋白即可。(2)使用不同蛋白酶酶解核桃蛋白制备出不同水解度的核桃蛋白酶解物,研究了核桃蛋白及其酶解物在体外模拟胃肠消化前后的抗氧化活性,并通过D-半乳糖诱导的SD大鼠氧化损伤模型进行体内验证。结果表明:核桃蛋白经过体外模拟胃肠消化后,DPPH自由基清除活性与还原力分别达到66.53%和8.55μmol TE/mL,其与低水解度(≤8%)的核桃蛋白酶解物的胃肠消化液相比无显著性差异(p>0.05),且高于高水解度(>8%)酶解物的胃肠消化物。动物实验结果表明,核桃蛋白及其酶解物均可显著缓解D-半乳糖诱导的氧化损伤大鼠的体重增长减缓,显著减轻肝脏、心脏和脾脏的氧化损伤(p<0.05);能够显著减轻氧化损伤导致的丙二醛含量的升高(p<0.01)、谷胱甘肽含量的降低(p<0.05)以及总还原力的降低(p<0.01)。核桃蛋白及其酶解物均具有良好的抗氧化效果,就抗氧化活性而言,没有必要进行酶促水解制备核桃多肽。(3)使用不同蛋白酶酶解核桃蛋白制备出不同水解度的核桃蛋白酶解物,研究了核桃蛋白及其酶解物在体外模拟胃肠消化前后的ACE抑制活性,并通过单次灌胃及长期灌胃原发性高血压大鼠,研究了核桃蛋白及其酶解物的体内降血压效果及作用机理。结果表明:体外模拟消化后,核桃蛋白的ACE抑制率达到44.85%,与不同水解度的核桃蛋白酶解物无显著差异(p>0.05)。在单次降血压实验中,灌胃核桃蛋白和核桃蛋白酶解物3 h后,收缩压分别达到最大降幅21.65mmHg和15.22 mmHg。长期灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物第2周大鼠收缩压开始下降,最大降幅分别为18.33 mmHg和24.42 mmHg。表明灌胃核桃蛋白与核桃蛋白酶解物均具有良好的降压效果。组织ACE活力和血清生化指标的结果表明:核桃蛋白通过降低主动脉(p<0.05)、肾脏(p<0.01)和肺(p<0.01)组织中的ACE活力,降低内皮素-1(p<0.01)和肿瘤坏死因子-α(p<0.01)的含量,同时升高血管舒缓激肽(p<0.01)和一氧化氮(p<0.01)的含量来达到降血压的效果。核桃蛋白酶解物通过降低主动脉(p<0.05)和肺(p<0.01)组织中的ACE活力,降低肿瘤坏死因子-α(p<0.01)的含量,同时升高血清中血管舒缓激肽(p<0.01)和一氧化氮合酶(p<0.01)的含量来降低血压。总之,核桃蛋白比核桃蛋白酶解物具有更稳定、更持久的降压效果,就降血压活性而言,没有必要进行酶促水解制备核桃多肽。