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背景与目的
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种常见的鼻咽部肿瘤，在西方国家很少发现，只有在中国的南部，如广东、广西、福建等地常见，主要发生在中年男性身上，严重威胁着我国人民的健康。它的病因主要有遗传因素、环境因素、病毒感染、饮食等。鼻咽癌的病理分型有角化性鳞状细胞癌、基底样鳞状细胞癌以及非角化性癌等，其中以未分化型的非角化性癌最为常见。该病起病隐匿，不易发现，易与鼻部的普通疾病相混淆，多数患者发现已是中晚期。临床治疗鼻咽癌早期以放疗为主、中晚期以放疗联合化疗为主，但这种治疗具有副作用大，组织损害程度重，易复发和转移等缺点，仍是困扰临床的一大难题。
尽管鼻咽癌的研究和治疗有所进展，但预后仍然很差。中医药治疗肿瘤，因其疗效好，毒副作用少等优点在临床上发挥着独特的优势，华蟾素能诱导多种肿瘤细胞凋亡，但其对作用于鼻咽癌的研究几乎没有，其作用机制更是少见，本研究的目的是探讨华蟾素诱导鼻咽癌细胞凋亡的分子机制。
细胞色素C(Cyt-C)和Caspase-9是线粒体凋亡途径中的特有蛋白，Cyt-C是线粒体凋亡途径中的标志性蛋白，在正常细胞中，Cyt-C表达量很少，而在细胞受到刺激后，Cyt-C从线粒体中释放出来，诱导细胞凋亡；Caspase-9是线粒体凋亡通路中的特异性分子，活化的Caspase-9仅在线粒体凋亡通路中诱导细胞凋亡，不参与其他途径引起的凋亡。线粒体凋亡是诱导肿瘤细胞凋亡的一个经典通路，为肿瘤的防治提供一个途径。因此，本课题通过检测Cyt-C和Caspase9的蛋白表达量来探讨华蟾素诱导CNE-2细胞凋亡的分子机制。
本课题通过体外实验研究华蟾素对人鼻咽癌细胞株CNE-2的增殖抑制作用，并运用现代生物分子学实验方法初步研究华蟾素诱导CNE-2凋亡的内在机制(线粒体通路)，为临床治疗鼻咽癌能够增加一种新的低毒高效的中药治疗药物提供一定的理论基础。
方法
1.实验分组：将体外培养的人鼻咽癌CNE-2细胞分为5组，即阴性对照组、阳性对照组(顺铂，浓度为2μg/mL)、华蟾素低剂量组(华蟾素1mg/mL)、华蟾素中剂量组(华蟾素2mg/mL)和华蟾素高剂量组(华蟾素4mg/mL)。
2.四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测华蟾素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖活性的影响，将华蟾素稀释成不同的浓度(4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL)，分别作用于CNE-2细胞12h、24h、36h、48h，并以阴性对照组和阳性对照组作对比，倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化，测量4个时间段的吸光度值(OD值)，计算华蟾素对CNE-2细胞的增殖抑制率。
3.免疫荧光染色法(AO/EB)观察华蟾素诱导CNE-2的细胞凋亡的形态变化。将各实验组和阴性对照组作用于分别培养CNE-2细胞24h和48h后，收集并洗涤细胞，用AO/EB荧光染色，在荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡的形态变化。
4.流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡率：将华蟾素各实验药物组作用于CNE-2细胞24h和48h后。收集并洗涤细胞，分别采用AnnexinV-FITC、PI双染法和检测细胞凋亡率，并用统计学软件分析其结果。
5．免疫印迹法(Western Blot)检测细胞内凋亡相关蛋白Cyt-C、Caspase-9的表达情况。将华蟾素各实验药物组分别作用于CNE-2细胞24h和48h后，收集细胞并提取细胞总蛋白，采用免疫印迹法检测线粒体凋亡通路相关蛋白(Cyt-C、Caspase-9)的相对表达量，并用统计软件分析其结果。
结果
1.MTT检测结果显示：与阴性对照组比较，华蟾素作用于人鼻咽癌CNE-2细胞后，能够抑制CNE-2细胞的增殖活性，差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着药物剂量的增加和给药时间的延长，抑制率升高。
2.AO/EB荧光染色法实验结果显示：倒置显微镜下观察，阴性对照组呈现全视野绿色均匀圆形的正常CNE-2细胞形态，用药组均呈现出一定比例的橘红色凋亡形态细胞，甚至可见橘红色的固缩状和新月形的死亡细胞，且随着用药剂量的增加和作用时间的延长，凋亡形态的细胞数增多。
3.流式细胞仪检测结果显示：与阴性对照组相比，华蟾素用药组的凋亡率增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着药物剂量的增加和作用时间的延长，凋亡率升高。
4.WesternBlot实验结果显示：与阴性对照组相比，华蟾素用药组线粒体通路相关蛋白Cyt-C、Caspase-9的表达量升高，且随着药物剂量的增加和作用时间的延长，表达量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论
华蟾素具有抑制人鼻咽癌CNE-2细胞增殖活性、诱导CNE-2细胞凋亡。可能是通过线粒体途径诱导CNE-2细胞凋亡，通过上调Cyt-C、Caspase-9的表达量实现。
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种常见的鼻咽部肿瘤，在西方国家很少发现，只有在中国的南部，如广东、广西、福建等地常见，主要发生在中年男性身上，严重威胁着我国人民的健康。它的病因主要有遗传因素、环境因素、病毒感染、饮食等。鼻咽癌的病理分型有角化性鳞状细胞癌、基底样鳞状细胞癌以及非角化性癌等，其中以未分化型的非角化性癌最为常见。该病起病隐匿，不易发现，易与鼻部的普通疾病相混淆，多数患者发现已是中晚期。临床治疗鼻咽癌早期以放疗为主、中晚期以放疗联合化疗为主，但这种治疗具有副作用大，组织损害程度重，易复发和转移等缺点，仍是困扰临床的一大难题。
尽管鼻咽癌的研究和治疗有所进展，但预后仍然很差。中医药治疗肿瘤，因其疗效好，毒副作用少等优点在临床上发挥着独特的优势，华蟾素能诱导多种肿瘤细胞凋亡，但其对作用于鼻咽癌的研究几乎没有，其作用机制更是少见，本研究的目的是探讨华蟾素诱导鼻咽癌细胞凋亡的分子机制。
细胞色素C(Cyt-C)和Caspase-9是线粒体凋亡途径中的特有蛋白，Cyt-C是线粒体凋亡途径中的标志性蛋白，在正常细胞中，Cyt-C表达量很少，而在细胞受到刺激后，Cyt-C从线粒体中释放出来，诱导细胞凋亡；Caspase-9是线粒体凋亡通路中的特异性分子，活化的Caspase-9仅在线粒体凋亡通路中诱导细胞凋亡，不参与其他途径引起的凋亡。线粒体凋亡是诱导肿瘤细胞凋亡的一个经典通路，为肿瘤的防治提供一个途径。因此，本课题通过检测Cyt-C和Caspase9的蛋白表达量来探讨华蟾素诱导CNE-2细胞凋亡的分子机制。
本课题通过体外实验研究华蟾素对人鼻咽癌细胞株CNE-2的增殖抑制作用，并运用现代生物分子学实验方法初步研究华蟾素诱导CNE-2凋亡的内在机制(线粒体通路)，为临床治疗鼻咽癌能够增加一种新的低毒高效的中药治疗药物提供一定的理论基础。
方法
1.实验分组：将体外培养的人鼻咽癌CNE-2细胞分为5组，即阴性对照组、阳性对照组(顺铂，浓度为2μg/mL)、华蟾素低剂量组(华蟾素1mg/mL)、华蟾素中剂量组(华蟾素2mg/mL)和华蟾素高剂量组(华蟾素4mg/mL)。
2.四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测华蟾素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖活性的影响，将华蟾素稀释成不同的浓度(4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL)，分别作用于CNE-2细胞12h、24h、36h、48h，并以阴性对照组和阳性对照组作对比，倒置显微镜下观察各组细胞的形态变化，测量4个时间段的吸光度值(OD值)，计算华蟾素对CNE-2细胞的增殖抑制率。
3.免疫荧光染色法(AO/EB)观察华蟾素诱导CNE-2的细胞凋亡的形态变化。将各实验组和阴性对照组作用于分别培养CNE-2细胞24h和48h后，收集并洗涤细胞，用AO/EB荧光染色，在荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡的形态变化。
4.流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡率：将华蟾素各实验药物组作用于CNE-2细胞24h和48h后。收集并洗涤细胞，分别采用AnnexinV-FITC、PI双染法和检测细胞凋亡率，并用统计学软件分析其结果。
5．免疫印迹法(Western Blot)检测细胞内凋亡相关蛋白Cyt-C、Caspase-9的表达情况。将华蟾素各实验药物组分别作用于CNE-2细胞24h和48h后，收集细胞并提取细胞总蛋白，采用免疫印迹法检测线粒体凋亡通路相关蛋白(Cyt-C、Caspase-9)的相对表达量，并用统计软件分析其结果。
结果
1.MTT检测结果显示：与阴性对照组比较，华蟾素作用于人鼻咽癌CNE-2细胞后，能够抑制CNE-2细胞的增殖活性，差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着药物剂量的增加和给药时间的延长，抑制率升高。
2.AO/EB荧光染色法实验结果显示：倒置显微镜下观察，阴性对照组呈现全视野绿色均匀圆形的正常CNE-2细胞形态，用药组均呈现出一定比例的橘红色凋亡形态细胞，甚至可见橘红色的固缩状和新月形的死亡细胞，且随着用药剂量的增加和作用时间的延长，凋亡形态的细胞数增多。
3.流式细胞仪检测结果显示：与阴性对照组相比，华蟾素用药组的凋亡率增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着药物剂量的增加和作用时间的延长，凋亡率升高。
4.WesternBlot实验结果显示：与阴性对照组相比，华蟾素用药组线粒体通路相关蛋白Cyt-C、Caspase-9的表达量升高，且随着药物剂量的增加和作用时间的延长，表达量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论
华蟾素具有抑制人鼻咽癌CNE-2细胞增殖活性、诱导CNE-2细胞凋亡。可能是通过线粒体途径诱导CNE-2细胞凋亡，通过上调Cyt-C、Caspase-9的表达量实现。