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1目的近年来,不育不孕的发病率显著增加,其中由男方因素引起的比例约占40%。导致男性不育的原因有2种:①由已知的病因如睾丸发育不良、隐睾、睾丸局部温度升高。②由未知的病因和发病机制引起的,此类不育症被称为特发性不育。五子衍宗丸一直广泛应用于治疗男性不育,且疗效显著。但五子衍宗丸的研究与探讨主要集中于睾丸生精细胞变化。然而,睾丸支持细胞是生精细胞的成熟和分化的基础,相邻的支持细胞通过连接形成的血睾屏障是精子正常发生的基础,但鲜有研究从这个角度探索五子衍宗丸作用和可能机制。本实验首先以离体培养的幼年大鼠和局部热激后的成年大鼠睾丸支持细胞为研究对象,来探讨五子衍宗丸对睾丸支持细胞和血睾屏障相关蛋白的作用与可能机制。以期为五子衍宗丸治疗不育症提供理论依据和新思路。2方法(1)分离20天幼年及60天成年SD雄性大鼠的睾丸支持细胞,在完全培养基(DMEM/F12培养液,10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素混合液)中培养。(2)将20天SD雄性大鼠睾丸支持细胞随机分为正常组,五子衍宗丸低剂量组(终浓度为5mg/ml)、中剂量组(终浓度为10mg/ml)、高剂量组(终浓度为15mg/ml)。药物作用时间分别为0h、4h、8h、16h、24h、32h。将60天的SD雄性大鼠睾丸支持细胞随机分为正常组,模型组,五子衍宗丸低剂量组(终浓度为5mg/ml)、中剂量组(终浓度为10mg/ml)、高剂量组(终浓度为15mg/ml)。其中模型组,五子衍宗低、中、高剂量组均经43℃水浴处理15min,以制造生精障碍模型。(3)通过MTT法观察不同药物作用时间、不同浓度的五子衍宗丸对幼年大鼠睾丸支持细胞增殖的影响;观察不同浓度的五子衍宗丸对成年大鼠睾丸支持细胞增殖的影响。(4)采用免疫组织化学方法观察幼年大鼠睾丸支持细胞中细胞增殖抗原Ki67的变化,观察成年大鼠睾丸支持细胞中细胞增殖抗原Ki67和AR蛋白的表达变化。(5)通过蛋白印迹法(Western blot)检测幼年大鼠睾丸支持细胞中Akt、p-Akt蛋白表达变化,成年大鼠睾丸支持细胞中AR、Akt、p-Akt、CK-18、ZO-1、occludin的蛋白表达变化。3结果(1)MTT检测结果:幼年大鼠睾丸支持细胞的五子衍宗丸各剂量组细胞数量较正常组显著增加(P<0.05),且随着剂量增加,幼年大鼠支持细胞增殖能力有升高的趋势。幼年大鼠睾丸支持细胞培养24h以内,随着五子衍宗丸药物作用的时间增加细胞数量增加。成年大鼠睾丸支持细胞的五子衍宗丸各剂量组细胞较正常组显著增加(P<0.05),且随着剂量增加,成年大鼠支持细胞增殖能力有升高的趋势。(2)免疫组化检测结果:幼年大鼠睾丸支持细胞的五子衍宗丸各剂量组Ki67蛋白阳性细胞数较正常组显著增多(P<0.05),且随着剂量的增加,阳性细胞数有增多的趋势。成年大鼠睾丸支持细胞的模型组Ki67蛋白阳性细胞数较正常组显著降低(P<0.05),五子衍宗丸各剂量组Ki67蛋白阳性细胞数较模型组显著增多(P<0.05),且随着剂量的增加,阳性细胞数也有增多的趋势。模型组AR蛋白阳性细胞数较正常组显著降低(P<0.05),五子衍宗丸各剂量组AR蛋白阳性细胞数均较模型组显著增多(P<0.05),且随着剂量的增加,阳性细胞数也有增多的趋势。(3)Western blot检测结果:幼年大鼠睾丸支持细胞五子衍宗丸各剂量组p-Akt蛋白相对表达量较正常组显著增高(P<0.05),且随着剂量的增加,蛋白相对表达量有增高的趋势。成年大鼠睾丸支持细胞的模型组AR、p-Akt蛋白相对表达量较正常组显著降低(P<0.05),而五子衍宗丸中、高剂量组的AR、p-Akt蛋白相对表达量均较模型组显著增多(P<0.05),且随着剂量的增加,蛋白相对表达量有增高的趋势。成年大鼠睾丸支持细胞的模型组CK-18蛋白相对表达量较正常组显著增高(P<0.05),而五子衍宗丸各剂量组CK-18蛋白相对表达量均较模型组显著降低(P<0.05),且随着剂量的增加,蛋白相对表达量有降低的趋势。成年大鼠睾丸支持细胞的模型组ZO-1、occludin蛋白较正常组显著降低(P<0.05),而五子衍宗丸各剂量组的ZO-1、occludin蛋白的相对表达量较模型组显著增多(P<0.05),且随着剂量的增加,蛋白相对表达量有增高的趋势。4结论(1)五子衍宗丸可能通过激活PI3K/Akt信号通路,促使Akt磷酸化,来促进幼年大鼠睾丸支持细胞的增殖。五子衍宗丸对幼年大鼠睾丸支持细胞的最佳药物作用时间是24h,且随着剂量的增加,药物增殖作用也随之上调。(2)五子衍宗丸可以促进成年大鼠睾丸支持细胞的增殖,且随着剂量的增加,药物增殖作用也随之上调。(3)五子衍宗丸可能通过上调AR蛋白表达水平,来诱导PI3K/Akt信号通路激活,从而下调CK-18蛋白表达,促进ZO-1蛋白、occludin蛋白表达,进而有效地抵抗了热激导致的支持细胞去分化和血睾屏障损伤,改善了生殖障碍,使精子能够正常发生。