论文部分内容阅读
在本研究中我们首次从雨蛙皮肤分泌液中分离得到了一种神经毒素(命名为Anntoxin)和一种干细胞自我更新支持因子(命名为AnSF)。随后，我们通过构建雨蛙皮肤cDNA文库，利用特异引物筛选到Anntoxin和AnSF的cDNA编码序列，前者的Gene Bank登录号为FJ598043，后者还在等待分配登录号。Anntoxin具有60个氨基酸，是一种Kunitz类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，构建Anntoxin的3D-NMR溶液结构，证实Anntoxin不同于有三对二硫键(键组合模式：1-6，2-4，3-5)的Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它只有两对二硫键(组合模式：1-4，2-3)。AnSF具有123个氨基酸，在C端具有和Calmadolin同源的两个EF手指结构，能够支持人类胚胎干细胞(hESC)和猴神经干细胞(rNSC)的自我更新。
为了进行Anntoxin的生物活性和结构分析，我们在体外成功表达了Anntoxin，获得了大量的重组Anntoxin(rAnntoxin)。经过生物活性分析，rAnntoxin和天然分离到的Anntoxin生物活性相当，都具有很强的胰蛋白酶抑制剂活性。Anntoxin是一种Kunitz类型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，和来源于芋螺(Cone Snail)的神经毒素Conkunitzin-S1，黑色眼镜蛇毒液(blackcobra，Dendroaspis polylepis polylepis)的树突毒素δ-DaTX或蛋白酶抑制剂K分别具有32.8％和36.7％的相同序列，和鱼类(fish)来源的Stonustoxin也有一定的同源性。利用膜片钳技术分别检测Anntoxin对大鼠背根神经节(rat DRG)上Na+通道，K+通道，Ca2+通道的作用，结果证明Anntoxin对河豚毒素敏感(TTX-S)的钠离子通道(Nav)有较强的抑制活性，对K+通道，Ca2+通道作用不明显。随后我们在非洲爪蟾卵母细胞上表达几种典型和常用于测试对亚型K+通道作用的Kv1.1，Kv1.2，Kv1.3，Kv2.1和Kv4.2，Kv4.3，Anntoxin对这些亚型K+通道上的K+电流都没有明显影响。我们成功构建了Anntoxin的3D-NMR溶液结构(NMR号：PDB ID2KCR，BMRB ID16094)，证实Anntoxin具有典型的Kunitz结构，由反向平行的β-折叠片和α-螺旋及转角组成梨形结构。利用RT-PCR，WesternBlot以及ELISA技术，发现在皮肤、脑、肝、胃和肠中都能检测Anntoxin mRNA转录，但只在皮肤、脑、肝和胃中有蛋白表达，表达量分别为29.5、5.39、4.80和2.02微克/克鲜重，可以看出Anntoxin在皮肤中大量表达，是皮肤分泌液中非常重要的组成部分。因为皮肤是雨蛙接触外界的第一屏障，雨蛙的生存环境中存在很多潜在威胁，比如微生物、吸血昆虫、鸟类、爬行动物、哺乳动物等，所以Anntoxin有可能是雨蛙适应环境的重要化学武器，于是我们测试了Anntoxin对甜菜夜蛾幼虫(Laphygma exigua Hubner)、水蛇(Enhydris plumbea)、鹌鹑(Coturnix coturnix)、昆明小鼠(Kunming mice)的急性毒性，其LD50分别为50，450，2500和3000微克/千克体重，说明在华西雨蛙皮肤中大量表达的Anntoxin对几类潜在天敌确实有较强的杀灭作用。
为了检测AnSF的生物学活性，我们在体外成功表达了AnSF，获得了大量rAnSF。设计三个浓度梯度10、100和500ng/ml，把AnSF和hESC共培养，发现在10～100 ng/ml浓度时对hESC的自我更新有支持作用；设计三个浓度梯度10、100和500ng/ml，把AnSF和rNSC共培养，发现在10ng/ml时对rNSC的自我更新有较强的支持作用。在超过500ng/ml高浓度时，AnSF对hESC和rNSC都有明显的细胞毒性作用，对rNSC的毒性作用更明显。利用RT-PCR技术，我们检测了雨蛙的皮肤、肌肉、肝脏、胰脏、胃、肠、心脏和脑，AnSF只在皮肤中有少量表达。这表明AnSF可能只参与雨蛙皮肤干细胞库的维持，保持皮肤内环境稳定，因为蛙类的皮肤细胞要负责产生大量活性物质参与先天免疫和抗氧化等重要的生理活动，需要经常更新，而AnSF的存在可能保证雨蛙皮肤干细胞库容量稳定，不断分化出各种成熟的皮肤细胞来使皮肤能够得到足够和及时的更新，保证其功能的正常行使。所以AnSF是维持华西雨蛙皮肤内环境稳定的重要物质。