第一部分崔学教教授治疗阳痿方剂的方药规律研究目的:阳痿是男子常见疾病,可因多种致病因素所致。2型糖尿病属“消渴”范畴,是其常见致病因素。长期的糖尿病可造成难治性糖尿病型阳痿,众多医家尝试采用各种特异性、经验性的方法试图改善糖尿病型阳痿患者勃起功能,但均收效甚微。崔学教教授是广州中医药大学教授、主任医师、中医外科学博士生导师、中西医结合临床外科学博士生导师,第三批、第六批全国名老中医药专家学术经验继承工作指导老师。勤耕临床五十余载,善治各种男科疑难杂症,尤其对2型糖尿病型阳痿有独到的认识和丰富的经验。本研究通过收集整理崔学教教授近5年来治疗2型糖尿病型阳痿病历,以病案为核心,采集患者年龄、病史、证型等信息,应用数据挖掘技术进行回顾性分析,归纳总结崔学教教授治疗阳痿方剂的用药及组方规律,通过复杂熵聚类分析得到新方,为更好的临床治疗方案提供数据基础,并以此为名老中医学术经验传承和2型糖尿病型阳痿临症施药提供借鉴。方法:采用登陆门诊医嘱系统检索、电话随访及门诊随诊等方式,以“勃起功能障碍”、“2型糖尿病”、“阳痿”、“消渴”等为关键检索词,收集2014.01.01至2018.12.31期间崔学教教授在广州中医药大学第一附属医院门诊所收治的符合纳入标准的2型糖尿病型阳痿患者的处方。并记录相关方剂的详细信息如:证型、方药、用法用量作为数据源。共筛选出治疗2型糖尿病型阳痿方剂214个。依据《中华人民共和国药典》,对214个方剂的药物名称进行规范统一,如:酒萸肉、山茱萸均统称为“山茱萸”;附子、制附子统称为“附子”等。规范后的方剂由专人录入由中国中医科学院中药研究院开发的《中医传承辅助平台》系统(V2.5),并进行二次审核确保数据的真实性及可靠性。结果:1.一般临床资料本次研究共筛选收集病例214例,所收录患者最小年龄25岁,最大年龄80岁,平均年龄37.44±8.67岁。2.中医症候分布经过筛选符合纳入标准的214例患者,研究者浏览门诊病例系统、患者病例等四诊合参资料及医嘱方药对其证型结合各证型诊断标准进行鉴定,取主要证型(第一证型),得出近三年来因糖尿病型阳痿就诊患者的证候分布,发现就诊患者实证和虚证所占比例相当,分别为44.9%和55.1%;其中,实证以血脉淤滞为主,占所有出现证候的21%,虚证命门火衰则占了绝大多数,比例为49.5%。将所有214名患者按按年龄区间分组后,各个年龄段患者分布情况及各个年龄组证候分布如图17所示,发现,所就诊患者以31～50岁的青中年人群为主体;各个年龄组证候表现出特异性分布,21～40年龄组以实证为主,而41～80岁年龄组以虚证为主。3.药物药性分析对崔学教教授治疗2型糖尿病型阳痿的相关中药四气属性进行频次分析后发现,所使用药物以温补为主,占61%,其次为平性药,占20.5%,再次为寒性药,占16.9%;五味属性频次分析则发现,药物药性以辛、甘为主,分别占24.0%、37%。4.药物归经对崔学教教授治疗2型糖尿病型阳痿的相关中药进行归经的频次分析,发现,最主要的药物归经以心、肝、脾、肾等四条经为主。5.药物频次对214首治疗阳痿的方剂进行药物描述性统计,由频次统计结果可知,214个治疗阳痿的方剂中共包含中药96味,其中,包含药物最多17味、最少7味。按药物出现频次排序,药物频次≥21次,即药物出现频率≥10%的中药共28味。7.关联规则分析根据关联规则Apriori算法,分别设置支持度为10%、20%、30%(表示该药物组合出现的频次至少占方剂总数的10%、20%、30%),置信度为0.9。分层次提取治疗痞满的核心药物组合,经“组方规律”分析,分别得出支持度为10%的核心用药组合19440个;支持度为20%的核心药物组合8237个;支持度为30%的核心药物组合8051个。8.复杂系统熵聚类分析应用复杂系统熵的方法,对214个方剂可能存在的药物组合进行进一步的关联性分析,依据复杂系统熵聚类的数据挖掘方法,参考方剂总数,对不同参数提取出的数据进行预读,最终设置相关度为5,惩罚度为2,进行层次聚类分析,得出核心用药组合6个。结论:在2014.01.01至2018.12.31期间崔学教教授所收治绝大多数患者以肾阳亏虚、瘀血阻络、湿热下注为主,并且患病人群逐渐年轻化。根据应用描述性统计、关联规则算法、复杂系统熵聚类分析发现,温阳活血方为治疗阳痿的主要方剂,并且在新方组合中提取的药物组合则提示还需注意同时兼用健脾化湿、利水通淋之品以助肾阳。第二部分基于NO/cGMP通路探讨蒺藜皂苷改善2型糖尿病型勃起功能障碍的机制目的:1.构建2型糖尿病型勃起功能障碍(Type 2 Diabetes Mellitus Erectile Dysfunction,T2DMED)大鼠模型;2.证实2型糖尿病通过介导氧化应激反应损伤内皮功能、促进阴茎海绵体平滑肌纤维化及凋亡导致勃起功能障碍;3.证实蒺藜皂苷能够通过改善T2DMED大鼠阴茎内皮功能上调NO/cGMP通路表达,改善平滑肌纤维化,抑制细胞凋亡,改善勃起功能。方法:1.T2DMED大鼠模型的建立将50只体质量约180～220g(6～7周龄),经阿扑吗啡(Apomorphine,APO)注射(予AP0 100 μ g/kg于大鼠颈后部皮下注射,放入透明实验观察笼,置于阴暗、安静的环境观察30min,记录有无勃起功能:大鼠阴茎勃起的标准为:阴茎膨大,包皮后退,龟头露出充血),确认有勃起功能的成年雄性SPF级SD大鼠随机分组,采用随机数字法将大鼠随机分为正常对照组(6只)及干预组(44只),两组均饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物实验室,设置实验环境为:光照环境:7:00-19:00光照、19:00-7:00黑暗;温度设置为:18～24℃;噪音控制在60dB以内;相对湿度控制范围为40%～70%;适应性喂养3天后,正常对照组予普通饲料及普通饮用水自由进食,并予双蒸水按15ml/Kg剂量灌胃,频率为1次/日;干预组予预先乳化的高糖高脂乳剂灌胃(约含10%胆固醇、35%猪油、2%胆酸钠和40%蔗糖),灌胃剂量为15ml/Kg,频率为1次/日,并补充以普通饲料自由进食及饱和蔗糖水和普通饮用水自由进食;8周后,正常对照组予注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(30mg/kg),所有干预组大鼠予腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(30mg/kg),以特异性破坏胰岛β细胞,复制T2DM模型。并在第3天及第7天分别用剪尾法测定血糖,并以随机血糖>16.67 mmol/L为成模标准,后每2周测定血糖1次,继续按前方案进食;第16周,测空腹血糖,并再次注射APO,筛选无勃起功能的大鼠,将随机血糖>16.67 mmol/L且无勃起功能的干预组T2DMED大鼠分为4组,共分5组,即:正常对照组(n=6),T2DMED 组(n=6),GSTT 组(n=6),Sildenafil 组(n=6),混合组(GSTT+西地那非)(n=6)。分组后,各组大鼠饮食均改为普通饲料和普通饮水自由进食,并分别予GSTT组蒺藜皂苷溶液(溶于双蒸水)40mg/kg/d灌胃,Sildenafil组予枸橼酸西地那非片混悬液(研磨成粉后溶于双蒸水)5mmg/kg/d灌胃,混合组予等量蒺藜皂苷(Gross Saponins of Tribulus Terrestris,GSTT)溶液40mg/kg/d+枸橼酸西地那非片混悬液5mg/kg/d灌胃;正常对照组及T2DMED组予等量双蒸水灌胃;各组大鼠每日灌胃1次,连续灌胃4周。2.勃起功能评价4周治疗结束后,予10%水合氯醛按1OOmg/kg剂量腹腔注射麻醉后,常规固定,备皮,消毒,行腹部及颈部正中切口,分别暴露双侧海绵体神经及颈总动脉;将双极银制电极置于右侧海绵体神经,并将2支与压力换能器相连接的23-G输液针分别插入右侧阴茎根部及右侧颈总动脉(输液管内充满250U/ml肝素生理盐水),并连接压力换能器,以分别记录ICP和MAP(ICP,Intra Cavernous Pressure:海绵体内压;MAP,Mean Arterial Pressure:平均动脉压;二者用于定量评估勃起功能),刺激参数设置为电压5V,频率20HZ,刺激持续时间30s,间隔5min。ICP与MAP的实际压力通过压力换能器转换为数字信号,通过Delphis电生理仪记录仪记录ICP值与ICP/MAP值。3.eNOS表达水平检测3.1免疫组化将组织样品固定,石蜡包埋,然后以5 μm厚度切片。脱蜡和再水合后,抗原修复及封闭后,在4℃下与抗内皮源性一氧化氮合酶(Endothelium-derived nitric oxide synthase,eNOS)一抗体孵育过夜。然后将切片与生物素缀合的二抗在37℃下孵育30分钟,随后在37℃下与抗生物素蛋白-4辣根素辣根过氧化物酶复合物孵育30分钟,然后用DAB色原体处理以进行反应,可视化。切片用稀释的苏木精复染,并用中性胶固定。每张切片随机选取五个高倍视野(200X)。使用Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件分析各组阴茎组织内 eNOS 免疫组化图片。3.2荧光定量PCR取大鼠阴茎海绵体组织,应用荧光定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测 eNOS mRN 表达情况。3.3免疫蛋白印迹法(Western blot)取大鼠阴茎海绵体组织,应用免疫蛋白印迹法检测eNOS蛋白表达情况。4.NO及cGMP表达水平测定取出试剂盒,室温放置约30分钟平衡至室温。在取酶标包被板的标准品孔中加入100 μ l标准品,待测样本孔中先加入待测样本20 μl,再加样本稀释液至100 μ l。混匀,在37℃恒温箱孵育20min。洗板:弃去液体,用干,加入洗涤液,甩去洗涤液,甩干,如此重复洗板4次。酶标工作液100 μl分别加到标准孔和样品孔,混匀,37℃恒温箱孵育30min。洗板:同上。100μ l 1XHRP分别加到标准孔和样品孔,混匀,37℃孵育30min。洗板:同上。100 μl 1TM显色液分别加到标准孔和样品孔,混匀,37℃孵育30min。100 μl终止液分别加到标准孔和样品孔,混匀,在15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。利用标准品的浓度和OD值,计算出直线回归方程,根据样本测量的0D值,计算出所测样品的浓度。5.ROS表达水平测定参照Davidson等的方法,采用DHE超氧化物阴离子荧光探针检测各组活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)表达情况,在200 x光学显微镜下在五个区域中拍摄每个切片的组织。使用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析。使用南京生物工程研究所开发的试剂盒进行组织ROS含量和组织匀浆粗提物蛋白质的测定。ROS含量定义为:反应体系中过氧化氢的浓度在37℃下每分钟每毫克组织蛋白减少1 μ mol作为抗反应氧单位(U/mg)。6.海绵体平滑肌纤维化水平测定采用Masson方法,根据Masson试剂盒说明对阴茎的中间部分进行切片和染色。光镜下观察阴茎海绵体内胶原组织(被染为蓝色或绿色)和平滑肌组织(被染为红色),采用Image-Pro plus 6.0软件分析海绵体平滑肌/胶原比例。7.阴茎海绵体细胞凋亡水平测定采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色方法,通过TUNEL凋亡检测试剂盒检测各组阴茎组织的细胞凋亡率(该程序根据试剂盒检测说明书进行)。用分析测量图像软件Image-pro plus 6.0分析每组阴茎组织的TUNEL图片(200X)。从每个样品中随机取出4个样品,用棕色深色染色染色的细胞是凋亡细胞,并且细胞与视野中细胞总数的比率是细胞凋亡率。结果:1.实验进展情况在整个实验过程中,正常对照组状态良好,无意外死亡;干预组表现出明显的多饮、多食、多尿症状,成模后体重无明显变化。实验过程中,干预组有15只未达到成模标准,其中6只未达到2型糖尿病标准,9只未达到勃起功能障碍标准;5只大鼠在高脂高糖乳化剂灌胃干预期间死亡。2.勃起功能评价GSTT组、Sildenafil及混合组大鼠ICP和ICP/MAP值较T2DMED组显著升高(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.05)。3.eNOS表达水平3.1免疫组化免疫组化检测则提示GSTT组及混合组eNOS表达较Sildenafil组和T2DMED组有显著增加(P<0.05),且二者无显著差异(P>0.05)。3.2荧光定量PCR荧光定量PCR检测则提示GSTT组及混合组eNOS mRNA表达较Sildenafil组和T2DMED组有显著增加(P<0.05),且二者无显著差异(P>0.05)。3.3免疫蛋白印迹法免疫蛋白印迹法检测则提示GSTT组及混合组eNOS mRNA表达较Sildenafil组和T2DMED组有显著增加(P<0.05),且二者无显著差异(P>0.05)。4.NO表达水平GSTT组及混合组与T2DMED组、Sildenafil组相比,能显著提高NO水平(P<0.05)。5.cGMP表达水平GSTT组和Sildenafil组在提升cGMP水平方面二者无显著差异(P>0.05),均显著高于T2DMED组(P<0.05),且混合组明显优于二者(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.05)。6.ROS表达水平GSTT组及混合组与T2DMED组、Sildenafil组相比,能显著降低ROS含量(P<0.05)7.阴茎海绵体平滑肌/胶原比例Masson染色提示GSTT组和混合组平滑肌/胶原比例较T2DMED组和Sildenafil组均有提高,差异有统计学意义(P<0.05),但仍低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。8.阴茎海绵体细胞凋亡指数TUNEL染色凋亡率检测则提示GSTT组和混合组凋亡指数较T2DMED组和Sildenafil组均有下降,差异有统计学意义(P<0.05),但仍高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.通过基础实验验证经过改进的高脂高糖乳剂灌胃诱导+腹腔注射STZ方法能够成功建立T2DMED模型;2.发现T2DM可通过介导氧化应激反应、海绵体内皮细胞凋亡及阴茎海绵体平滑肌纤维化导致勃起功能障碍;3.证明GSTT具有轻度的调节血糖作用并能够通过降低ROS含量改善大鼠体内氧化应激反应;4.表明GSTT可抑制T2DMED大鼠阴茎海绵体内细胞凋亡改善大鼠阴茎海绵体内皮功能,提高eNOS、NO、cGMP的表达,改善勃起功能;5.证实GSTT可改善平滑肌纤维化,提高勃起功能;6.证实GSTT在改善T2DMED大鼠勃起功能方面,与Sildenafil有协同效应。