本文在对小菜蛾高致病力玫烟色拟青霉菌株筛选的基础上,研究了玫烟色拟青霉的生物学特性,通过扫描电镜、透射电镜和病理组织切片观察了玫烟色拟青霉对小菜蛾的入侵行为和侵染过程,还研究了玫烟色拟青霉侵染对小菜蛾生理生化指标的影响,以及小菜蛾血细胞对玫烟色拟青霉的抵御作用,明确了玫烟色拟青霉对小菜蛾的致病机理。主要结果如下:　　 1.玫烟色拟青霉不同致病力菌株的筛选　　 以分离自家白蚁的玫烟色拟青霉原始亲本菌株PFCF-001,以及PFCF-001的退化菌株PFCF-D作为出发菌株,单胞分离了104个子菌株。将所有菌株依照菌落生长形态区分为菌丝型、孢子型和菌丝孢子型3种类型,初筛获得5个菌株,分别为菌丝孢子型菌株PFCF-001,孢子型菌株PFCF-D58和菌丝型菌株PFCF-D、PFCF-D20、PFCF-D50,结合生物测定的结果,筛选出两个对小菜蛾具有不同致病力且性状优良的菌株PFCF-001和菌株PFCF-D58,对小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率分别达97.74％和51.44％,作为本研究的高致病力菌株和低致病力菌株。　　 2.玫烟色拟青霉常规接种方式对其致病力的影响　　 在浸叶法、浸虫法、涂抹法和喷雾法4种室内常用接种方式中,1×107孢子/Ml的处理浓度下,菌株PFCF-001以浸虫法处理对小菜蛾各龄幼虫的校正死亡率最高,分别为2龄97.74％、3龄97.33％和4龄95.83％;并且对小菜蛾各龄幼虫的致病速度最快,LT50值分别为2龄18.13h、3龄18.56h和4龄22.25h,因而以浸虫法作为本研究的标准接种方式。　　 3.玫烟色拟青霉的最适培养条件　　 培养基、温度、光照、通气等培养条件对玫烟色拟青霉高致病力菌株PFCF-001生长特性的研究结果表明,CPAY培养基所含组分能够较好的满足菌株营养生长和生殖生长所需。菌株在CPAY培养基上菌丝生长最快,为13.28mm/d,产孢量最高,达2.94×107孢子/Ml,孢子萌发率显著高于其他培养基,达62.59％。最适的培养温度为25℃。光照对菌落生长有促进作用,但对产孢有抑制作用,全黑暗条件最适于培养该菌。平板培养过程中可选用家用保鲜膜代替帕拉膜封口培养皿。　　 4.玫烟色拟青霉生物学特性及对小菜蛾致病力的相关性　　 玫烟色拟青霉高致病力菌株PFCF-001生长速率呈先快后慢的趋势,平板培养20d后产孢量达2.7×107个/Ml,孢子萌发率为62.59％,胞外蛋白酶水平为1.16。而菌株PFCF-D、PFCF-D20、PFCF-D50和PFCF-D58间平均生长速率和孢子萌发率无显著差异。产孢量变化范围为1.05×107～2.34×107个/Ml,胞外蛋白酶水平变化范围1.02～1.07,各生物学指标及其对小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率皆显著低于高致病力菌株PFCF-001。分析各菌株致病力与各项生物学指标之间的相关性得出,玫烟色拟青霉对小菜蛾的致病力与菌株生长初期的生长速率、产孢量、孢子萌发率和胞外蛋白酶水平正相关,与菌株生长后期的生长速率负相关。　　 5.玫烟色拟青霉的几丁质酶和弹性蛋白酶Pr1活性　　 分别用液体培养法、琼脂平板透明圈法和虫体诱导法测定了玫烟色拟青霉5个菌株的几丁质酶活性,结果表明玫烟色拟青霉高致病力菌株PFCF-001的几丁质酶产酶水平显著高于低致病力菌株PFCF-D58。液体培养法所测菌株PFCF-001的几丁质酶活性变化范围为4.75～37.4 IU/Ml,琼脂平板法所得比值在1.03～1.56之间,两种方法测得的酶活性变化趋势一致。虫体诱导法下菌株PFCF-001的几丁质酶活性变化范围为6.65～78.15 IU/Ml,显著高于液体培养法。玫烟色拟青霉Pr1酶活性随诱导时间逐渐增高,虫体诱导法测得的PFCF-001菌株Pr1活性最高值达2.342μg.ml-1·min-1,显著高于菌株PFCF-D58的最高值0.877g.ml-1·min-1。虫体诱导法的Pr1酶活性明显高于明胶培养基法,推测与虫体表皮上含有刺激孢子大量产生胞外蛋白酶的特殊成分有关。　　 6.小菜蛾感染玫烟色拟青霉菌后的病征　　 小菜蛾幼虫的足部、虫体中部、气门窝和腹侧是分生孢子最先入侵的部位。感病虫体体表颜色随入侵时间由局部浅褐色逐渐变为大面积深褐色,病虫出现缩短、强直等外部形态的变化。　　 7.玫烟色拟青霉侵染小菜蛾体表的扫描电镜观察　　 玫烟色拟青霉分生孢子在小菜蛾体表所有部位皆能附着,在嵴状结构区和刺状结构区,菌株PFCF-001的附着率分别为88.89％和91.07％,显著高于PFCF-D58菌株的23.17％和17.78％,可见菌株的致病力与分生孢子在小菜蛾体表上的附着力有关。分生孢子萌发后可形成附着胞,菌株以附着胞、芽管或菌丝直接穿透寄主体表,菌株PFCF-001与PFCF-D58分别于接种后1 h和2h分生孢子在小菜蛾体表开始萌发,4h和24h出现附着胞或以芽管直接穿透体壁。寄主体表结构影响附着胞形成及穿透体壁时芽管长度,在嵴状结构区的入侵芽管最短,刺状结构区次之,平缓结构区最长。嵴状结构区和刺状结构区比平缓结构区更易形成附着胞,因而更利于玫烟色拟青霉的入侵。　　 8.感染玫烟色拟青霉的小菜蛾病理组织观察　　 玫烟色拟青霉菌株PFCF-001入侵小菜蛾有两条途径。第一条入侵途径为体表途径。第二条入侵途径为消化道途径。接种后4h,附着于体壁的分生孢子开始萌发入侵。16h后,小菜蛾内表皮被分解,菌丝段进入血腔。与此同时,被幼虫取食进入消化道的分生孢子也增殖产生菌丝段,以菌丝段突破肠壁细胞,向附近的脂肪体入侵。随着玫烟色拟青霉继续在死虫体内增殖,各组织器官遭到不同程度破坏。48h后,感菌幼虫死亡,虫尸体内的菌丝突破体表,在虫体外形成菌丝层。　　 9.玫烟色拟青霉侵染小菜蛾的透射电镜观察　　 玫烟色拟青霉接种至虫体后分生孢子4h后可形成附着孢穿透表皮,接种后24h已普遍侵入体腔。玫烟色拟青霉在表皮和体腔内,以菌丝段出芽生殖、菌丝分隔及菌丝段分隔3种方式大量增殖,主要以颗粒状的菌丝段在寄主体腔内扩散,菌丝段在穿透表皮和体腔内增殖过程中均伴随着机械压力和酶的活动。　　 10.玫烟色拟青霉侵染对小菜蛾虫体蛋白含量的影响　　 玫烟色拟青霉高致病力菌株PFCF-001处理后,幼虫各部位蛋白含量总体呈逐渐下降的趋势。在侵染初期,脂肪体的蛋白含量下降趋势最明显,说明此时脂肪体对入侵菌体起主要的抵抗作用。侵染中期,血淋巴蛋白含量从12h的5.29mg/Ml下降至24h的3.17mg/Ml,表明此时血淋巴在与入侵菌体的斗争中被大量的消耗。在侵染后期,占虫体大部分体积的中肠和表皮的蛋白含量下降趋势最剧烈。至接种后42h,虫体表皮、中肠、血淋巴和脂肪体蛋白含量分别出现最低值为1.22 mg/Ml、0.95 mg/Ml、1.62 mg/Ml和0.92 mg/Ml。而低致病力菌株PFCF-D58对虫体各部位蛋白含量的影响不显著。　　 11.玫烟色拟青霉对小菜蛾体内保护酶活性的影响　　 小菜蛾感染玫烟色拟青霉后体内SOD酶活性呈先增加后下降的趋势。菌株PFCF-001感染小菜蛾8h后,虫体内SOD酶活性就出现了最高值;而菌株PFCF-D58感染小菜蛾后12h,虫体内SOD酶活性才出现最高值,说明高致病力菌株比低致病力菌株更快的诱导了SOD酶活性的提高。在侵染后期(24-72h),菌株PFCF-001的侵染使虫体内SOD酶的合成受到抑制,其活性逐渐下降至接近0的水平;而菌株PFCF-D58的侵染对虫体SOD酶活性影响不大,其活性仅下降至对照水平。感菌虫体CAT酶和POD酶活性变化规律较一致,皆为感染前期较平稳而后期出现先上升后下降的趋势,低致病力菌株PFCF-D58感染的虫体CAT酶和POD酶最高值分别为0.7471μ/Ml和4.755×10-3μ/Ml、高致病力菌株PFCF-001感染的为0.762μ/Ml和3.881×10-3μ/Ml,说明高致病力菌株的侵染使虫体POD酶受到抑制。　　 12.玫烟色拟青霉对小菜蛾体内解毒酶活性的影响　　 高致病力菌株PFCF-001在侵染前期有短暂诱导CarE酶和GSTs酶活性增加的作用,在侵染后期起抑制作用,其感染的小菜蛾虫体CarE酶活性在12h出现最高值0.497μmol/mg pro-min,GSTs酶活性在24h出现最高值84.38μmol/mg pro·min,之后由于虫体受到严重损伤,两种酶活性急剧下降至低于对照,并无法恢复正常水平。低致病力菌株PFCF-D58可持续诱导CarE酶和GSTs酶活性的增加,其CarE酶活性在12h出现最高值0.403μmol/mg pro·min,GSTs酶活性在42h出现最高值79.38μmol/mg pro·min。小菜蛾幼虫在受侵染初期虫体两种解毒酶活性变化皆很激烈,这说明两种酶都具有重要的防御作用。总体上GTSs酶活性水平比CarE酶活性水平高,表明GTSs酶在抵抗菌体入侵的作用上高于CarE酶。　　 13.小菜蛾血细胞对玫烟色拟青霉的防御作用　　 小菜蛾4龄幼虫血细胞主要有原血细胞、粒血细胞、浆血细胞和珠血细胞4种类型,其中浆血细胞和珠血细胞数量最多,分别达到400个/mm3和250个/mm3。小菜蛾血细胞对入侵的玫烟色拟青霉能够产生一系列防卫反应,对菌体进行粘附、吞噬、包被及形成结节等,反应高峰期在侵染后16h-36h间,参与防御反应的血细胞主要是浆血细胞和珠血细胞。