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蚊作为一种媒介生物,可以传播多种疾病(如疟疾、寨卡热、登革热、黄热病、丝虫病、乙型脑炎等),给人类健康构成了极大威胁。其中,疟疾为传播最广、感染人数最多的疾病,人类感染疟疾主要由按蚊属传播。近年来,随着全球变暖,蚊的栖息地和生活习性受到影响,其所传播的疟疾流行范围和时间也随之发生改变,这对疟疾等蚊传疾病的防控工作带来巨大的挑战。本研究以斯氏按蚊为动物模型,针对温度对斯氏按蚊繁殖能力和疟原虫易感性的影响及其分子机制进行了下述三部分的探索,以期阐明不同温度下斯氏按蚊繁殖能力、生存时间的变化规律和对约氏疟原虫易感性的差异及其部分分子机制,为气候变化下蚊虫种群密度变化和疟疾传播流行的预警和科学制定防治对策提供参考和科学依据。方法:1.温度对斯氏按蚊繁殖能力的影响及分子机制研究。在5个不同温度(16℃、20℃、24℃、28℃、32℃)下饲养斯氏按蚊,饲血后观察斯氏按蚊在不同温度下产卵数量、产卵率、产卵时间以及生存时间的差异。并分别于吸血当天未吸血时和吸血后第1、3、5天时,提取蚊总RNA,利用RT-qPCR技术检测5个温度下各时间点卵黄蛋白原(Vg)的转录水平,分析Vg在温度对按蚊产卵能力影响中的作用。2.温度影响斯氏按蚊对约氏疟原虫易感性及分子机制研究。将斯氏按蚊成蚊分组饲养于五个不同温度下(16℃、20℃、24℃、28℃、32℃),利用感染了约氏疟原虫的小鼠对三天龄斯氏按蚊进行饲血和攻击感染,在饲血当天未饲血时和饲血后第1、3、5天分别提取不同温度组按蚊总RNA,利用RT-qPCR技术检测蚊天然免疫不同信号通路关键分子的转录水平。在感染后第九天,解剖成蚊中肠,在荧光显微镜下观察计数蚊胃基底膜上的疟原虫卵囊并进行比较分析。3.温度对斯氏按蚊肠道菌群的影响。将同一天羽化的斯氏按蚊分组于五个不同温度(16℃、20℃、24℃、28℃、32℃)下饲养至三天龄,解剖蚊肠道,置入盛有1ml无水乙醇的EP管,每组三个重复,送诺禾致源公司,利用16S rDNA高通量测序技术比较分析不同温度下蚊肠道菌群的差异。结果:1.环境温度对于按蚊繁殖能力和生存时间影响较大。当温度低至16℃时,斯氏按蚊吸血率低且停止产卵繁殖,存活时间中位数为2.0 d,提示16℃的低温环境不适合斯氏按蚊的繁殖生存。在20～28℃温度范围内随着环境温度升高,斯氏按蚊的产卵时间逐渐缩短、产卵数量逐渐增高、生存时间逐渐延长,当环境温度升至32℃,斯氏按蚊的产卵时间虽进一步缩短,但产卵数量减少且生存时间缩短。综合各研究结果,提示28℃是斯氏按蚊繁殖和生存的最佳环境温度。为了进一步阐明环境温度对按蚊繁殖能力影响的分子机制,本研究利用荧光定量PCR的方法比较分析了对蚊产卵至关重要的分子Vg在不同温度下的转录水平。研究结果显示,Vg转录水平在16℃下吸血前后始终处于基础低表达水平,其它各组在吸血后24h升高非常显著,且各温度组间的转录水平差异与产卵数量差异趋势一致(有统计学差异),吸血后3d骤降,吸血后5d接近基础低水平。本研究结果提示,Vg在按蚊的产卵中起着重要的作用,且环境温度可能通过影响按蚊Vg的转录水平而改变蚊的繁殖能力。2.温度对于按蚊的疟原虫易感性影响非常明显。约氏疟原虫对斯氏按蚊的感染率和感染度在24℃环境温度下最高,其次是20℃,环境温度过高和过低均不利于疟原虫在蚊体内的发育。斯氏按蚊Toll、Imd和JAK-STAT等天然免疫信号通路的多个关键分子在不同环境温度下的转录水平差异显著。其中,在24℃环境温度下蚊抗疟原虫天然免疫反应最弱,而温度如果低于或高于24℃,免疫效应都会有所增强,提示按蚊天然免疫机制可能参与了温度对其疟原虫易感性的影响。3.不同温度下斯氏按蚊肠道菌群组成差异明显。各组间物种丰富度比较显示,28℃组明显低于其它温度组,16℃组最高。五个温度组间共有的OTUs数为277个,从16℃到32℃每个温度特有的OTUs数量依次为1062、595、1022、88、326个,28℃组明显少于其它组。各温度组间蚊肠道菌群物种组成相对丰度差异明显,提示温度可影响不同类细菌的组成比例。例如,28℃组蚊肠道菌群的葡糖杆菌属(Gluconobacter)比例明显高于其他温度组(文献提示该类细菌可能与蚊免疫反应和生长发育相关),而32℃组的Lactobacillus丰度最高。不同温度组间蚊肠道菌群组成的相似性(UPGMA聚类分析)和相异系数(距离指标)比较分析显示,28℃组与其他各组差异最为明显。结论:1.明确了不同温度下斯氏按蚊繁殖能力和生存时间的变化规律和适宜斯氏按蚊繁殖生存的最佳环境温度(28℃),其分子机制可能是通过温度影响蚊卵黄蛋白原表达水平而实现的。2.环境温度对按蚊的疟原虫易感性影响较大,24℃的环境温度更适宜于约氏疟原虫感染斯氏按蚊;斯氏按蚊Toll、Imd和JAK-STAT等天然免疫信号通路可能参与了温度对按蚊疟原虫易感性的影响。3.证实了温度对斯氏按蚊肠道菌群的影响明显,蚊肠道菌群的组成种类和丰度都随温度不同而发生变化;28℃组蚊肠道菌群的葡糖杆菌属(Gluconobacter)比例明显高于其他温度组,该菌群组成的变化可能与斯氏按蚊繁殖能力和疟原虫易感性有关,为进一步明确肠道菌群的改变是否参与了温度对按蚊繁殖能力和疟原虫易感性的影响奠定了基础。