广藿香毛状根的诱导、离体培养及其植株再生

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本文首次研究了发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834对药用植物广藿香(Pogostemon cablin)的遗传转化、毛状根培养及其液体培养过程中培养液营养成分的消耗变化以及毛状根的植株再生。结果如下:   广藿香叶片外植体被发根农杆菌ATCC15834感染8 d后,从叶脉处陆续分化出乳白色的不定根,其中以预培养2 d、侵染时间20 min、共培养2 d时的外植体毛状根诱导率最高,达80%。毛状根能在无外源激素的培养基上自主生长,呈密集丛生状、多分枝,被大量白色细绒毛。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表达。   在四种不同的培养基中,最适合广藿香毛状根生长的固体培养基是6.7-V,培养20 d,毛状根鲜重增值倍数为10.03,干重增值倍数为9.48。   广藿香毛状根在6.7-V液体培养基中的生长曲线基本呈”S”型。在0~12 d内处于生长迟滞期、12~24 d为快速生长期、24 d后进入生长平台期。培养液中的蔗糖、氨态氮、硝态氮和磷酸盐的消耗过程都与毛状根的生长曲线基本同步。培养28 d后,硝态氮仍有10%未被消耗和利用,而蔗糖和氨态氮则几乎被消耗完全,磷酸盐被彻底消耗完全。相反地,毛状根对钙的吸收和利用要比硝态氮和无机磷慢得多,培养至28 d时,培养基中仍残存约占起始浓度49.1%的Ca2+。   广藿香毛状根可在MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L的培养基上先形成愈伤组织,再逐渐分化出芽,50天后芽诱导率为36%。毛状根也可先在MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基上形成愈伤组织,30天后愈伤组织诱导率为100%;然后转入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基中诱导出芽,35天后芽诱导率为100%。最适宜生根培养基为1/2MS。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根再生植株的基因组中整合及表达。
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