抽薹是一种特殊而又重要的遗传性状,普遍存在于十字花科植物（例如结球甘蓝Brassica oleracea L.var.capitata L.）等多种科属植物中。对于结球甘蓝而言,在生产上,如果播种时期不适或者品种选择不当,有时会出现“先期抽薹”从而降低其营养器官的品质和产量,因此往往要调节好播种期或选用适宜播种季节的品种,避免未熟抽薹;在育种上,为了加代繁殖、缩短育种周期、加快育种进程,往往需要提早抽薹、促进开花:在F1制种上,为了调节父本和母本花期相遇、避免或减少假杂种的产生,又要对双亲抽薹开花的一致性进行调控。所以对结球甘蓝抽薹研究显得非常必要。抽薹是结球甘蓝从营养生长阶段向生殖生长阶段转化的关键时期,也是甘蓝成花的前期过程和必经阶段。所以,对甘蓝成花的前期过程——抽薹的机理及其调控研究,无论从生产、育种、还是F1制种上,都具有非常重要的实践意义。与开花一样,抽薹是结球甘蓝一种非常复杂的生殖发育相关的性状。抽薹性状一旦明显表现,就很难进行有效的调控。但是,如果对抽薹的萌动或启动（具备了抽薹的潜能但抽薹性状还未明显表现出来）即抽薹启动的机理进行研究,则可有望从抽薹的源头进行本质上的调控,从而获得理想的效果。抽薹启动和花芽分化均是十字花科植物开花的必经阶段。十字花科植物的开花过程可分为两个阶段（Ottoline Leyser,2003）:在第一阶段茎端分生组织（Shoot Aprical Meristem,SAM）从营养性生长状态转变为生殖性生长状态,即营养分生组织（Vegetative Meristem,VM）转变为花序分生组织（Inflorenscence Meristem,IM）;在第二阶段IM转变为花分生组织（Floral Meristem,FM）,然后每一个FM分化为一朵完整的花。结球甘蓝等十字花科植物抽薹启动是从VM向IM的转变,其花芽分化是从IM向FM的转变。结球甘蓝抽薹这一特殊性状的最初萌动（抽薹启动）是如何开启和驱动?目前还未见这方面的研究报道。为了深入研究结球甘蓝抽薹启动的生化和分子机理,本研究首先采用二次正交旋转设计,建立了室内重复、可靠、高效的温光诱导结球甘蓝ZQ的启动抽薹体系,可实现一年多代和一株多次双重繁殖,为甘蓝启动抽薹的机理、开花时间的分子调控、雌蕊雄蕊发育机制、花粉柱头互作模式、雄性不育和自交不亲和性机理等生殖发育学的深入研究提供了可靠的活体实验平台。然后对其生化响应和分子机理进行了较为系统研究,明确了结球甘蓝抽薹启动的生化感应机理及其相关基因差异表达机制,为茎端营养分生组织VM向花序分生组织IM生殖发育转变的生命本质及其细胞命运的深入研究提供了借鉴。此外,克隆了结球甘蓝LFY_ZQ,并通过LFY_ZQ等13种十字花科作物LFY的分子进化聚类分析,发现了LFY与植物的春化类型相关,为种子春化类型和绿体春化类型植物的分型方法、耐抽薹和易抽薹种质资源的鉴定,及其分子机理研究提供了另外一条试验思路和解决途径。主要研究工作和结果总结如下:1.甘蓝抽薹启动的温光诱导体系本研究采用温度（x₁）、光周期（x₂）、处理时间（x₃）三因素的二次正交旋转设计,以RXZ-300D型智能人工气候箱进行温光控制,待结球甘蓝“ZQ”茎基部（第一片真叶着生处）茎粗5.5-5.6mm时开始进行温光诱导处理,筛选甘蓝抽薹的温光诱导体系。实验建立了相应的回归方程:y_ZQ=4.266×10^-2+1.755×10^-3x₂x₃-4.73×10^-3x₁x₂。并进一步采用恒低温（4℃低温16h光照/4℃低温8h暗培养）和变低温（7℃低温16h光照/4℃低温8h暗培养）两种处理方式,对诱导抽薹条件进一步验证和优化,结果表明:在16h长日照、4℃/7℃变温下处理甘蓝65d,然后转入再培养体系（20℃、16h光照/18℃、8h黑暗）,均可在6d内快速使甘蓝100%启动抽薹,中心柱上相邻叶片距离增加,菜薹伸长,剥开植株1-2片心叶,肉眼可见茎尖上有绿色小点状突起。再隔4d后,菜薹伸长至菜口平齐,绿色小突起已发育成花蕾。按照该温光诱导抽薹体系,进行了一年多代繁殖和一株多次繁殖研究。若采用一年多代繁殖方式,甘蓝一个世代大约150d,甘蓝种子繁殖时,一年之内约可连续繁殖2个世代。若采用一株多次繁殖方式,甘蓝植株可以实现多年生长、多次抽薹开花、一株多次繁殖。植株生长发育到第三世代。均能够正常抽薹、现蕾、开花、结籽。2.甘蓝抽薹启动的生化机理研究结球甘蓝“ZQ”茎粗5.5-5.6mm时放于7℃低温16h光照/4℃低温8h暗培养,处理65d后,将植株移到20℃、16h光照/18℃、8h黑暗下再培养诱导抽薹。在再培养初期（抽薹启动期0-6d）内每天测定可溶性蛋白质、可溶性糖、游离氨基酸、抗坏血酸、淀粉合成酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶含量等8项生化指标,研究抽薹启动期的生化代谢机理。采用SPSS13.0软件进行因子分析,结果表明:甘蓝在抽薹启动期有2个物质代谢跃变,即第2-3d和第4-5d。相关分析表明:存在极相关（α≤0.01）的有:可溶性蛋白质和Vc呈负相关,相关系数为-0.866;POD和可溶性糖呈正相关,相关系数为0.862;POD与游离氨基酸呈负相关,相关系数为-0.899;淀粉合成酶与CAT呈正相关,相关系数为0.973。存在强相关（0.01＜α≤0.05）的有:可溶性蛋白质与游离氨基酸呈正相关,相关系数为0.755;淀粉合成酶与游离氨基酸呈正相关,相关系数为0.674。存在弱相关（0.05＜α≤0.1）的有:游离氨基酸与可溶性糖呈负相关,相关系数为-0.566;POD与可溶性蛋白质呈负相关,相关系数为-0.631。其余指标之间相关性不显著。主成分分析表明:8项指标分成3个主成分,第一主成分上有可溶性蛋白质、可溶性糖、游离氨基酸、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸（Vc）,这5项指标与启动甘蓝抽薹的关系密切;第二主成分上有过氧化氢酶（CAT）、淀粉合成酶,这2项指标与抵抗逆境的关系密切;第三主成分上有超氧化物歧化酶（SOD）,与抗衰老的关系密切。甘蓝在启动抽薹期,可溶性蛋白质和游离氨基酸含量逐渐增加,而可溶性糖和过氧化物酶呈先减后增趋势,Vc的含量先减后增再逐渐减少。3.甘蓝抽薹启动相关基因表达的差异显示为鉴定甘蓝启动抽薹差异表达基因,应用cDNA-AFLP技术,以结球甘蓝材料ZQ为研究对象,对甘蓝启动抽薹前后（变低温处理结束;回温处理72h内）茎尖的基因表达进行了mRNA指纹分析。首先以甘蓝ZQ为试验材料,对启动抽薹的cDNA-AFLP反应体系中的模板浓度、Taq酶浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度等因素进行了筛选,并经1%琼脂糖电泳随机抽检、6%聚丙烯酰胺电泳检测和cDNA差示带回收验证,建立了稳定可靠的cDNA-AFLP优化体系:在25μL的PCR反应体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg²⁺浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶加入0.04U/μL时,选扩的效果最佳。然后通过64对引物组合的筛选,共分离得到76个差异表达的转录衍生片段（TDF）,其中上调表达或启动抽薹后特异性表达TDF 67条,下调表达或启动抽薹前特异表达TDF 9条。对其中丰度高的10个上调表达和5个下调表达的TDF分别克隆、测序、序列分析。结果表明:15个TDF按照同源性归为四类:激素级联反应系统2个（T5A6-2、T5A5-2均为上调表达）、氧化还原酶系统3个（T7A2-2、T2A7-2为上调表达,T8A6-1为下调表达）、叶绿体和线粒体系统6个（T8A2-3、T5A8-1、T2A7-3、T8A3-3为上调表达,T6A6、T8A6-2为下调表达）、矿质营养应答系统等4个（T8A3-2、T2A7-1为上调表达,T5A3、T5A4为下调表达）,它们与甘蓝启动抽薹的关系密切。4.LFY_ZQ克隆与分析及在抽薹启动期的表达分别提取甘蓝ZQ抽薹启动的茎端组织DNA和RNA,以引物对1（LFY-F1、LFY-R1）和引物对3（LFY-F3、LFY-R3）分别克隆了LFY_ZQ基因。引物LFY-F1、LFY-R1扩增的甘蓝LFY基因DNA和cDNA的序列分别为1348bp、834bp;引物LFY-F3、LFY-R3扩增的甘蓝LFY基因DNA和cDNA的序列分别为1317bp、510bp。将两对引物扩增产物的测序结果拼接,得到甘蓝LFY基因DNA和cDNA序列长度分别为2560bp、1239bp。BLAST核苷酸同源性在线分析表明,结球甘蓝ZQ的LFY基因与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜的同源性分别达到91%、87%、86%、87%。DNAstar分析表明:甘蓝LFY基因含有三个外显子和两个内含子,第一、二、三个外显子分别为452bp、394bp、393bp,共编码412个氨基酸;第一、二个内含子分别为514bp、807bp,两个内含子的剪切位点均符合经典的GT-AG法则（内含子5′端碱基为GT,3′端碱基为AG）。利用Vector NTⅠ软件将结球甘蓝LFY_ZQ基因三个外显子编码氨基酸位置（0-151、152-282、283-412）与花椰菜（B.oleracea var.botrytis）、芥菜（B.juncea Coss）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）、萝卜（B.Raphanus sativus）比对分析,编码氨基酸序列保守性为:第三外显子＞第一外显子＞第二外显子;而内含子两侧的氨基酸保守性为:第二内含子＞第一内含子。将LFY_ZQ与网上公布的12种十字花科植物的LFY氨基酸序列进行亲缘关系分析,13种植物LFY分成了两大类:第一大类包括芸薹属的花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis L.）和结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata L.）,以及Jonopsidium属的植物Jonopsidium acaule。这3种植物均属于绿体春化类型。第二大类包括10种植物:拟南芥（鼠耳芥）属（Arabidopsis）的拟南芥、芸薹属的芥菜（Brassica juncea Coss.）、山芥属（Barbarea）的欧洲山芥菜、Selenia属的Selenia aurea voucherE.Lyons、筷子芥属（Boechera）的台湾筷子芥、荠菜属（Capsella）的荠菜、Stanleya属的Stanleya pinnata、Streptanthus属的Streptanthus glandulosus、Idahoa属的Idahoa scapigera、萝卜属（Brassica Raphanus sativus）的萝卜。这10中植物（例如萝卜、芥菜、拟南芥）都属于种子春化类型。从LFY的进化分类可以推测,LFY与植物的春化类型是相关的。LFY_ZQ蛋白的分子量为46kD,理论等电点为6.87,原子组成是C₂₀₁₉H₃₁₅₇N₅₉₉O₆₀₅S₁₆,蛋白稳定系数为50.89,是一个不稳定蛋白,脂肪系数为72.77,总平均亲水性=-0.565,是一个疏水蛋白。该蛋白存在N-十四（烷）酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,酰胺化位点,其中N-十四（烷）酰化位点集中分布在蛋白质的N端,其余三种活性位点主要分布在LFY_ZQ蛋白的中部和C端。半定量RT-PCR分析表明,LFY_ZQ在启动抽薹（甘蓝“ZQ”茎粗5.5-5.6mm时放于7℃低温16h光照/4℃低温8h暗培养,处理65d后,将植株移到20℃、16h光照/18℃、8h黑暗下0-6d内）的0-2d表达较弱,而从第3d开始表达增强,3-6d的表达均强于0-2d。