蚕丝是家蚕(Bombyx mori)分泌的一种天然高分子蛋白,主要由丝素纤维和丝胶蛋白两部分组成。丝胶蛋白是包裹在丝素纤维外部的一种层状胶体蛋白,约占蚕丝总重的25%～30%,可以将丝素纤维粘合在一起形成牢固的茧壳结构。一般认为丝胶蛋白含有两层或两层以上的结构,外层的丝胶蛋白由家蚕中部丝腺的前部细胞合成,内层的丝胶蛋白由家蚕中部丝腺的后部细胞合成。在丝绸产业中,丝胶蛋白会影响丝织物的光泽和手感,并影响后期印染等工艺。将蚕丝中丝胶蛋白去除的过程被称为脱胶,丝胶蛋白常随着大量的脱胶废水被排放,造成严重的环境污染和生物资源浪费。近年来,随着生物医学工程的飞速发展,丝胶蛋白因其优异的生物学性能逐渐得到了研究者的关注。丝绸文化已有千年历史,在纺织缫丝工艺中,常利用沸水、碱性溶液、酸性溶液、蛋白酶或表面活性剂等混合脱胶剂对蚕茧进行脱胶。虽然可以通过透析或膜超滤等现代工艺对脱胶溶液进行丝胶的纯化和回收,但成本过高,严重限制了其实用性。至今仍未有标准化的、实用的、绿色的蚕丝脱胶方法面世。因此,需要人们开发低成本、高效率、绿色的丝胶提取方法。在已有关于新型脱胶方法的报道中,人们大多关注脱胶方法对丝素纤维的影响,而忽视其对丝胶蛋白的回收和性能的影响。因此,本文将通过三种绿色的脱胶方法分层制备丝胶蛋白,并对三种丝胶蛋白的理化性质和体外生物学活性进行系统化的分析比较。一般剧烈的脱胶条件可以提高脱胶效率,但会造成丝胶蛋白严重降解。温和条件的脱胶效率较低,内层的丝胶蛋白难以完全去除。作者在不引入脱胶剂的条件下对丝胶采用分层制备的方法。首先,洁净茧壳通过纯水加热煮沸1 h,可获得脱胶率约12%的外层丝胶蛋白。其次,这些未完全脱胶的茧壳通过120℃高温高压水进行第二次脱胶2 h,便可获得剩余部分的内层丝胶蛋白。在本文中,通过第一次沸水脱胶得到的丝胶蛋白被称为外层丝胶蛋白(Outer layered sericin,OLS),将通过高温高压水第二次脱胶的丝胶蛋白称为内层丝胶蛋白(Innerlayered sericin,ILS)。此外,氢氧化钙[Ca(OH)2]水溶液作为一种新型的绿色脱胶剂,其获得的碱性脱胶溶液可以通过与硫酸/磷酸中和反应,使脱胶液中的钙离子生成钙盐而沉淀,此法不仅可以快速分离纯化丝胶蛋白,还可以回收钙盐循环利用,本文将此法制备的丝胶蛋白称为全丝胶(whole sericin,WS)。这三种丝胶蛋白的理化特性和体外生物学活性在本文的第一部分中做了系统地分析和研究比较。蚕丝脱胶方法会影响丝胶蛋白的分子量范围和氨基酸组成,从而影响其理化性质和生物学活性。本文中OLS、ILS和WS三种丝胶的脱胶率分别为11.4%,16.65%和28.61%。碱法制备的WS分子量最低,SDS-PAGE电泳条带主要集中在10 kDa～30 kDa,这使其在室温下具有最好的水溶解性能。OLS和ILS的分子量较大,溶解度在温度升至70℃后才会快速升高。氨基酸分析显示OLS中谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸等极性氨基酸含量明显高于ILS。富含亲水基团的OLS表现出较强的吸湿、保湿能力,在12 h内的吸湿率超过了 12.5%,8h内的保湿率约为85%。OLS、ILS和WS的热分解温度分别约为308℃、322℃和311℃,ILS的β-折叠结构含量高于OLS,其热分解温度也比OLS高约14℃,表明ILS具有较高的稳定性,可以在自然环境中对丝素纤维起到保护作用。三种丝胶蛋白的X-射线衍射曲线均在20.8°处出现结晶峰,说明三种脱胶方法对丝胶蛋白的结晶度没有显著影响。此外,三种丝胶蛋白都具有明显的抗紫外活性,其中小分子的WS更易被人体吸收利用,具有作为化妆品原料的潜力。ABTS法和FRAP法实验结果显示三种丝胶蛋白的抗氧化能力顺序为:OLS>WS>ILS,另外20 mg/mL的OLS对大肠杆菌的抑制率可达到50%。OLS和WS的酪氨酸酶抑制曲线的 IC50 值分别为 8.67 mg/mL 和 3.49 mg/mL,10 mg/mL 的 OLS 和 WS 对 α-葡萄糖苷酶的抑制率分别达到了 65.62%和51.3%。这些结果表明,这三种丝胶在理化性能上存在一些差异,但都具有明显的抗氧化、抗紫外、抗菌、吸湿保湿、美白和体外降血糖等功能。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)是生物3D打印领域中一种常用的生物墨水材料,本文通过将OLS、ILS、WS分别与GelMA混合制备三种丝胶/明胶复合型水凝胶(SS/GelMA),探索丝胶蛋白应用于生物墨水的可能性。实验结果显示这三种丝胶蛋白的添加不会影响GelMA水凝胶的可塑性,且SS/GelMA复合水凝胶的平均孔径约为150μm,其具有的三维网络结构可以满足细胞生长的需求。力学测试结果显示含有较多β-折叠结构的ILS可以将纯GelMA水凝胶的压缩强度从0.21 MPa提升至0.28 MPa,将其抗压性能提高了 25%。由于丝胶蛋白未改变GelMA的分子结构,所以其对GelMA水凝胶的溶胀性能几乎没有影响。经中性蛋白酶处理10天后,除WS/GelMA外,其余两种SS/GelMA复合水凝胶的质量保留率均在80%以上。在药物缓释实验中,OLS/GelMA、ILS/GelMA和WS/GelMA复合水凝胶在第5天的药物释放率分别达到了 78%、62%和70%左右,显示出应用于再生医学领域的潜能。体外细胞培养的结果表明OLS浓度为1%时,过量的OLS会导致OLS/GelMA复合水凝胶产生细胞毒性。将丝胶浓度降低到0.5%、0.25%、0.1%后,所有SS/GelMA复合水凝胶均表现出更高的细胞活性。与培养在纯GelMA水凝胶支架上细胞相比,SS/GelMA复合水凝胶上的细胞伪足较长,呈纺锤状生长。表明SS/GelMA复合水凝胶可以加快L929细胞的粘附,使细胞提前进入快速生长期,表现出优异的细胞相容性。利用绿色的脱胶方法,分层制备OLS、ILS和WS三种丝胶蛋白。一系列实验结果证实,这三种丝胶蛋白均具有优异的理化性能和体外生物学活性。其中具有较好生物学活性的OLS和热稳定性较高的ILS可以作为医用生物材料或工业表面改性材料,而小分子WS具有应用于生物制药、功能性健康食品和化妆品等领域的巨大潜能。同时,这三种丝胶蛋白都可以提高GelMA的机械性能、细胞粘附性和生物相容性,具有应用于生物墨水领域的潜在价值,这为蚕丝产业的可持续发展和高附加值产品开发提供了重要的参考价值。