精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)具有自我更新和向成熟功能精子分化的能力,是雄性生物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。猪精原干细胞在转基因猪的生产和再生医学猪模型的建立中具有重要的应用价值。然而,由于猪睾丸中精原干细胞数量少,且缺乏理想的长期稳定的培养体系,长期培养猪精原干细胞的研究和应用受到很大的阻碍。在本研究中,通过将表达猿猴病毒40(SV40)大T抗原的质粒包装慢病毒后转导到猪原代精原干细胞中,首次培养出两种具有猪精原干细胞属性的永生细胞系。进一步通过试验发现:(1)永生化的猪精原干细胞在培养过程中经历了逐渐的形态转化,经过培养从圆形/椭圆形转变为扁平形。通过对微丝、微管的染色发现,细胞的形态也是正常的,无多倍体的细胞出现。(2)在使用了RA(维甲酸)对永生化细胞系进行处理后,发现永生化的猪精原干细胞系对RA的处理有应答,但分化有限,其特点是PLZF出现微弱的下调,STRA8上调,C-KIT表达稳定,细胞形态无明显变化。(3)猪精原干细胞的标志物UCHL1,PLZF和THY1在整个培养过程中均有表达,生殖细胞标志物VASA和DAZL也都有表达,归巢相关因子CXCR4也有表达,增殖标记物PCNA在各代中均有表达,永生化SV40大T抗原也有表达。(4)通过对永生化的猪精原干细胞进行异体移植,并对受体小鼠做了荧光观察、曲细精管染色、冰冻切片染色等检测,观察到永生化猪精原干细胞可以在曲细精管的基底膜上定植,也证实了其干细胞特性。(5)通过检测了细胞核型和DNA含量,结果显示染色体数目有减少,部分染色体发生了畸变。与原代精原细胞相比,永生化细胞的DNA含量也发生了改变。本试验所构建的猪精原干细胞永生化细胞系现已培养7个月以上,传代35次以上,未见形态异常。因此,建立的永生化猪精原干细胞系可以为猪精原干细胞自我更新和分化的机制研究提供丰富的细胞来源,从而促进猪原代精原干细胞长期培养体系的建立及其在畜牧业和医学上的应用。