番茄黄化曲叶病是影响番茄生产的严重病害,该病是由双生病毒科番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)引起。番茄一旦感染了黄化曲叶病,叶片就会出现卷曲皱缩,黄化等症状,进而导致坐果率下降,番茄严重减产,并且品质也会下降。番茄栽培种中缺乏抗黄化曲叶病毒的抗性基因,仅在近缘野生番茄品种中发现了Ty-1,Ty-2,Ty-3,Ty-4,Ty-5等抗性位点。Ty-2是抗病效果最好的一个基因。目前抗病品种的选育是通过近缘野生种和栽培种杂交,将抗病基因转育到栽培品种中。我们对含有抗性位点Ty-2的番茄材料CLN2777A和感病材料4840进行转录组差异分析,发现TYLCV侵染后,Le ACT1在抗病材料中表达上调,而在感病材料中其表达下降,推测该基因可能参与了抗病过程。本研究首先利用RT-PCR克隆该基因,并对其进行生物信息学分析。然后通过荧光定量RT-PCR对其进行组织表达以及诱导表达差异分析。同时利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)以及转基因过表达对Le ACT1进行功能分析。另外,利用烟草瞬时侵染对Le ACT1的启动子进行表达特征分析。最后,测定了转基因植株的PAL酶活,初步探讨其抗性机制。主要研究结果如下:通过RT-PCR的方法克隆该基因,并命名为Le ACT1。测序结果表明该基因编码区为1332bp,编码443个氨基酸,蛋白质分子量为50.5KD,等电点为6.07。尽管抗感材料中该基因编码区没有差异,但是在启动子区域抗感材料之前的相似性仅为89%。利用Realtime RT-PCR分析,发现Le ACT1在叶片中的表达量较其他组织低,在花蕾,皮层以及根中的表达量较高。另外,叶片诱导表达分析结果表明在抗病材料中,TYLCV处理3d后,Le Act1基因表达量开始上升并在处理后5天达到最高值。构建该基因与GFP4融合的亚细胞定位载体并瞬时侵染烟草,发现该融合蛋白在细胞核及细胞膜上均有分布。将来源于抗病材料的启动子构建到PBI101载体上,通过烟草瞬时侵染分别与病毒蛋白基因共注射,利用GUS染色研究启动子的表达特征。结果表明,TYLCV各个蛋白基因都能诱导番茄Le ACT1启动子的活性,其中AC2和C1的诱导作用最为显著。构建Le ACT1的基因沉默载体,分别将抗感番茄材料中的目的基因沉默,并通过Real-time RT-PCR检测VIGS的沉默效率,表明目的基因的表达量下降60%,但表型并未发生明显改变。对沉默植株接种TYLCV,15d后沉默植株中的病毒量是对照的30倍,同时,叶片出现扭曲、皱缩等畸形表型。构建Le ACT1的过表达载体并转化本氏烟,筛选出阳性植株9株。取其中目的基因表达量最高的4个株系进行抗性鉴定分析。结果表明转基因烟草植株对TYLCV的抗性显著提高,相对病毒数较费转基因植株下降40%-90%。为了验证Le ACT1的抗性是否具有广谱性,同时对转基因植株接种落叶型黄萎病V991,对照野生型病指达到85.36%,而3个转基因株系的病指仅为24.35%,38.19%和58.33%。接种15d后转基因株系的TYLCV病毒数较对照显著降低。为了初步研究Le ACT1对黄萎病的抗性机制,测定了离体叶片接种黄萎菌后的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,结果表明转基因烟草植株的PAL活性较对照显著增加。上述结果表明,Le ACT1启动子在抗感材料中差异显著并且活性受TYLCV基因的诱导,说明抗病启动子识别在抗性作用中起关键作用,番茄Le ACT1对番茄黄化曲叶病毒具有抗性,可应用于抗病新种质创制。