【摘 要】
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背景与目的:恶性黑色素瘤是一种起源于皮肤及其他器官黑色素细胞的肿瘤,具有转移高、预后差的特点。尽管最近的研究导致新疗法的快速发展,但转移性恶性黑色素瘤患者的5年生存率仍然只有20%。个体化靶向治疗和免疫治疗是恶性黑色素瘤治疗的重要手段。临床上,约70%的BRAF突变患者通过阻断RAS-MAPK通路从联合靶向治疗中获得长期益处,但由于耐药性的发展,这些抑制剂在临床治疗中明显受到限制。因此,探索恶性黑
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背景与目的:恶性黑色素瘤是一种起源于皮肤及其他器官黑色素细胞的肿瘤,具有转移高、预后差的特点。尽管最近的研究导致新疗法的快速发展,但转移性恶性黑色素瘤患者的5年生存率仍然只有20%。个体化靶向治疗和免疫治疗是恶性黑色素瘤治疗的重要手段。临床上,约70%的BRAF突变患者通过阻断RAS-MAPK通路从联合靶向治疗中获得长期益处,但由于耐药性的发展,这些抑制剂在临床治疗中明显受到限制。因此,探索恶性黑色素瘤转移和耐药机制一直是研究人员面临的严峻挑战。最近研究发现,Capicua（CIC）作为一种高迁移率族蛋白抑制因子,不仅参与哺乳动物的正常发育和稳态调节,而且在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤表达异常,可通过MAPK/ERK通路控制效应靶基因来促进肿瘤发生发展。CIC基因与肿瘤增殖、转移和治疗耐药密切相关,但是,CIC是否影响黑色素瘤的发生和进展还尚未见相关报道。基于此,本研究为探讨CIC基因是否在黑色素瘤的增殖、转移等恶性生物学行为中发挥作用,通过生物信息学分析CIC在恶性黑色素瘤中的功能,采用RNA干扰技术观察沉默CIC基因后对黑色素瘤细胞增殖、迁移能力的影响。方法:利用在线数据库分析CIC突变在恶性黑色素瘤及治疗耐药情况;下载TCGA数据库中皮肤恶性黑色素瘤（skin cutaneous melanoma,SKCM）样本,筛选CIC突变组和野生组的差异表达基因,并进行功能富集分析。采用小干扰RNA（si RNA）构建沉默CIC基因的黑色素瘤细胞株,经q RT-PCR（quantitative real-time PCR）验证是否成功构建;采用CCK-8实验、细胞克隆实验、transwell细胞迁移实验、划痕实验检测si RNA组和si RNA-NC组细胞的增殖、迁移能力,探讨CIC基因对黑色素瘤细胞增殖和迁移能力的影响。并且,采用Western blot实验检测两组细胞转移相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和MMP9）的表达水平,采用皮下移植瘤实验观察肿瘤生长情况,进一步探讨CIC基因对黑色素瘤增殖、转移能力的影响。此外,使用CDK抑制剂Dinaciclib处理黑色瘤细胞株,CCK-8实验及细胞克隆实验检测Dinaciclib对细胞增殖的影响,探讨CDK抑制剂在沉默CIC基因的恶性黑色素瘤细胞中的作用。结果:（1）基于TCGA数据库,CIC在SKCM中有多个位点突变,突变率为5%,且CIC突变在泛癌中对曲美替尼等多种药物具有耐药;在SKCM中,与野生组相比,CIC突变组中41个基因的蛋白表达上调,10个基因的蛋白表达下调,其中,MMP9在两组中存在显著差异。KEGG通路分析差异表达基因在沙门菌感染、泛素介导的蛋白水解、内噬作用、细胞周期等多条通路富集。（2）qRT-PCR显示成功构建CIC si RNA的A375、Hs294T细胞株;CCK-8实验、细胞克隆实验显示,CIC si RNA转染的黑色素瘤细胞增殖能力增强（p＜0.01）、克隆形成率增加（p＜0.01）;transwell细胞迁移实验及划痕实验显示,CIC si RNA转染的黑色素瘤细胞迁移数量增加（p＜0.01）。（3）Western blot实验显示,CIC si RNA转染的黑色素瘤细胞转移相关蛋白MMP9、N-cadherin和Vimentin的表达水平增加,E-cadherin的表达水平减少;皮下移植瘤显示,CIC si RNA转染的黑色素瘤细胞皮下成瘤体积和重量增加（p＜0.01）。（4）CCK8、细胞克隆实验显示,无论是否沉默CIC,与DMSO组相比,加入Dinaciclib后恶性黑色素瘤细胞增殖减少（p＜0.05）;并且随着Dinaciclib浓度增大,抑制作用越明显（p＜0.05）。结论:沉默CIC基因促进黑色素瘤细胞的增殖、迁移能力,CDK抑制剂Dinaciclib对CIC基因沉默后的恶性黑色素瘤细胞具有抑制作用。
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