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近来在大多数的细菌(40%)和几乎所有的古细菌(90%)的基因组中,人们发现一类成簇的、有规律间隔的短回文重复结构家族(clusteredregularl y interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。 CRISPR主要用于细菌防御外来噬菌体、病毒的侵袭,从而使细菌能够在残酷的自然环境中生存下来,是一种适应性的免疫机制。CRISPR系统的作用是提供对噬菌体特异性免疫,在生物医学,生物工业上都有广阔的前景。结核病是目前单一致病菌中致死率最高的传染病之一,我国是全球结核病高负担国家之一,结核病患者人数位居世界第二。结核病的病原体是结核分枝杆菌,结核分枝杆菌易发生耐药性,近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐药菌株和泛耐药菌株逐渐增多,甚至引起暴发流行,使得目前的药物已不足以抑制。因此,对于结核病的致病菌——结核分枝杆菌的致病机制和免疫机制的深入研究显得极为重要。CRISPR系统是结核分枝杆菌重要的免疫机制之一,本研究着重于对结核分枝杆菌的CRISPR系统中的Cas蛋白进行初步探索。根据目前在一些细菌中的研究成果,预测结核分枝杆菌也存在CRISPR系统。CRISPR系统包括一系列Cas蛋白,这些蛋白协助CRISPR系统发挥免疫作用。CRISPR系统发挥免疫作用分为两个步骤。首先,噬菌体入侵细菌,Cas蛋白将其识别,并整合到宿主的基因组上。然后,噬菌体第二次入侵,CRISPR系统能够识别外源噬菌体,用具有特异性核糖核酸内切酶功能的Cas蛋白将其切割,外源噬菌体失去毒力,免疫过程结束。在这个过程中,Cas1和Cas2蛋白参与获取外源噬菌体基因的过程,Cas6蛋白是核糖核酸内切酶,能够切割CRISPR repeat RNA,在宿主细菌防御外源噬菌体的过程中扮演了重要的角色。本研究首先成功构建了3个重组表达质粒MBP-Rv2816、MBP-Rv2817以及MBP-Rv2824,并在原核中得到高效表达。目的基因Rv2816、Rv2817以及Rv2824对应的目的蛋白分别是Cas1-mbp、Cas2-mbp以及Cas6-mbp。我们选择的表达质粒是PDB-His-MBP载体,MBP标签大小为45KDa。载体上的标签MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。纯化蛋白使用的是镍离子亲和层析的方法。带有His标签的融合蛋白特异性结合在镍离子亲和层析胶体(即柱材料)上。结合在柱材料上的融合蛋白可用400mM高浓度咪唑的生理缓冲液进行洗脱。就三个目的蛋白的表达情况来看,16℃诱导表达的融合蛋白Cas1-mbp和Cas6-mbp有较好的溶解性,Cas2-mbp在纯化得到之后,降解程度严重。将融合蛋白Cas6-mbp用于后续功能的研究,在体外构建了Cas6-mbp蛋白切割CRISPR-repeat RNA和切割CRISPR-spacer RNA的体系。实验样品分为两组,反应底物分别是CRISPR-repeat RNA和CRISPR-spacer RNA。在RNA的量不变的条件下,Cas6-mbp蛋白的量沿梯度浓度增高。实验另外设置有RNA阴性对照。实验结果发现Cas6蛋白能够切割CRISPR-repeat RNA,但不能够切割CRISPR-spacer RNA。本研究初步阐释了结核分枝杆菌中存在CRISPR系统,验证了在结核分枝杆菌基因组中确实存在Cas1、Cas2、Cas6蛋白基因,并且能够进行表达纯化,其中Cas6蛋白具有核糖核酸内切酶的功能。这一研究结果可能有助于对结核分枝杆菌免疫机制的深入了解,对以后的生物医学发展有比较重要的参考价值。