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血管重构是指因血管内皮损伤,血管壁细胞活化、增殖、迁移和分泌,细胞外基质沉积等多种病理因素所致的血管壁厚度和/或管腔大小以及功能发生的代偿性或失代偿的变化。血管重构性疾病包括动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、血管成形术后再狭窄(restenosis after angioplasty,RS)及高血压(hypertension,HT)等。在认识血管重构病理机制的过程中,对中膜平滑肌细胞和外膜成纤维细胞的作用分别进行了较深入的研究。然而,血管各层细胞之间并非孤立存在,各层细胞之间存在相互作用。近年来研究发现,血管内皮细胞和平滑肌细胞之间通过缝隙连接的作用产生相互影响;同时血管内膜损伤后,伴随外膜的早期炎症反应,这种非特异性炎症促进了外膜成纤维细胞的活化、迁移、增殖和分泌。这提示我们,血管外膜成纤维细胞通过中膜到达内膜过程中,是否通过缝隙连接对中膜平滑肌细胞产生作用?本实验将通过采用外膜成纤维细胞(AF)-中膜平滑肌细胞(SMC)直接接触培养的方式,构建AF-SMC共培养模型,用非特异性免疫激发剂活化成纤维细胞,观察成纤维细胞与平滑肌细胞间是否形成了缝隙连接,AF-SMC共培养对两种细胞增殖、分泌及细胞周期的影响,以期初步阐明AF与SMC之间的相互作用,二者共同参与血管重构的病理机制。益气活血解毒方是在传统益气活血功效的基础上加用解毒药。前期工作表明,该方通过抗炎、抑制血管外膜成纤维细胞活化、迁移和分泌防治血管重构。本研究采用益气活血解毒方冻干粉作用于成纤维细胞,以观察该方通过抑制炎症反应对成纤维细胞的活化和增殖,进一步抑制成纤维细胞对平滑肌细胞激活的药理机制,为中西医结合防治血管重构性疾病提供新的思路和依据。目的1建立成纤维细胞(AF)-平滑肌细胞(SMC)共培养模型,采用直接接触共培养的方式,用非特异性免疫激发剂活化成纤维细胞造模,以探讨血管外膜成纤维细胞被活化后,是否促进SMC增殖?是否与SMC形成缝隙连接?二者实现功能同步共同参与血管重构;2观察益气活血解毒方能否抑制AF,进一步抑制平滑肌细胞,从而达到防治血管重构。方法1大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞和中膜平滑肌细胞的原代培养及细胞鉴定:组织贴块法分别培养成纤维细胞和平滑肌细胞,经过传代、差异贴壁、鉴定、冻存、复苏、培养,建立稳定的细胞实验平台。2观察脂多糖(LPS)对成纤维细胞增殖的影响:采用LPS作为炎性刺激因子,CCK-8法及ELISA法测定LPS造模后成纤维细胞增殖及分泌的细胞因子变化。3建立AF-SMC直接接触共培养模型:首先用LPS刺激AF活化,再去除LPS,然后将AF-SMC直接接触共培养。观察AF-SMC共培养细胞增殖、细胞周期和细胞分泌的变化,CCK-8法直接观察活化的成纤维细胞对AF-SMC细胞增殖的影响;采用流式细胞术观察AF-SMC细胞周期;ELISA法测定AF-SMC分泌的MMP-2及TIMP-2的变化。4建立AF-SMC直接接触共培养模型,采用透射电镜观察AF-SMC共培养后两种细胞的形态以及两种细胞间缝隙连接结构。5观察益气活血解毒方对成纤维细胞增殖和AF-SMC共培养细胞周期的影响:CCK-8法测定益气活血解毒方对LPS造模后AF增殖的干预作用;流式细胞术检测益气活血解毒方对AF-SMC细胞周期的影响;ELISA法测定益气活血解毒方对AF-SMC分泌TIMP-2的变化。结果1原代成纤维细胞为多角形,呈放射状或网织状生长,免疫细胞化学Desmin染色细胞浆未着色,而Vimentin染色胞浆呈棕黄色,表明是血管外膜成纤维细胞,排除是平滑肌细胞的可能。原代平滑肌细胞多角形或长梭形,呈“峰谷”状生长,Desmin和Vimentin免疫细胞化学染色胞浆均呈棕黄色,表明是平滑肌细胞。2脂多糖浓度为5μg/ml和10μg/ml时,作用于成纤维细胞24h时有诱导其增殖的作用。酶联免疫吸附法测得,5 μg/ml脂多糖作用AF 24小时,培养液中IL-6的含量明显增多(P<0.05),而10μg/ml组差异不明显。因此选用浓度为5μg/ml的LPS,作用24h为实验刺激浓度和时间。3与正常AF-SMC组相比较,活化的AF与SMC共培养(LPS+AF-SMC组),可明显促进两种细胞增殖;细胞周期分析发现,LPS+AF-SMC组的S期(DNA合成期)细胞所占百分比升高(P<0.05),说明AF经LPS刺激后,共培养细胞增殖更加活跃;ELISA法检测结果显示,AF-SMC共培养各组MMP-2无明显变化,活化后的AF上清中TIMP-2明显减少(P<0.01),与AF-SMC组相比,LPS+AF-SMC组TIMP-2含量明显增多(P<0.05)。4 透射电镜下观察,LPS诱导活化后的AF核变大变宽,核异型,并具有了肌细胞的特征。AF-AF与SMC-SMC间有缝隙连接的存在,正常的AF-SMC间有缝隙连接,活化的AF与SMC间亦形成了缝隙连接。5 益气活血解毒方可明显降低AF的增殖,而对AF-SMC共培养细胞周期及分泌的TIMP-2无明显影响。在益气活血解毒方组未观察到AF与SMC间的缝隙连接。结论1 LPS能诱导体外成纤维细胞的增殖,提示外膜的非特异性炎症反应可刺激AF的活化增殖和分泌细胞因子,为观察AF对SMC的作用提供了前提和条件。2 活化的AF可促进AF-SMC直接接触共培养细胞增殖和DNA合成增加,TIMP-2的分泌增加,提示活化的AF与SMC间存在相互作用,两种细胞相互作用后,它们的功能或是正向调节或是负向调节。3 活化的AF与SMC间形成了缝隙连接,提示成纤维细胞通过缝隙连接与平滑肌细胞进行信号传递,可能是两种细胞相互作用的结构基础,但缝隙连接的种类和功能有待进一步研究。4 益气活血解毒方可明显抑制AF的增殖,可能是其防治血管重构的主要机制。在本实验条件下,未能观察到该处方对AF-SMC共培养细胞增殖和分泌TIMP-2的干预效果。益气活血解毒方对AF与SMC间缝隙连接的影响还需要进一步确认。