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作为高密度脂蛋白(HDL)的重要组成蛋白,载脂蛋白ApoA-I(polipoprotein A-I)两大重要功能为:一,在胆固醇逆转运(RCT)过程中起辅助作用;二,卵磷脂胆固醇酞基转移酶(LCAT)可以被有效激活。作为最原始的脊索动物中的头索动物,文昌鱼成为了探究脊椎动物如何进化与起源的典型模式生物。由于白氏文昌鱼在生物进化地位具有特殊地位,所以本研究以此实验对象,能使脊索动物ApoA-I的研究更为深入,并能进一步揭示脊椎动物免疫系统方向的进化进程。本文首次对白氏文昌鱼apoA-I基因的通过基因克隆、荧光实时定量、生物信息分析等技术进行了分析,初步研究结果如下:1、本研究首次应用PCR技术获得了从白氏文昌鱼脊索中克隆了 cDNA全长。cDNA全序列有1023 bp,氨基酸编码序列340 aa。apoA-I基因编码区由六个内含子和七个外显子构成,ExPASy在线预测白氏文昌鱼的apoA-I基因的理论分子量大约为39.9 kDa,预测其理论等电点(pI)为8.77。其氨基酸序列中富含Glu(14.1%)和Lys(11.2%)。通过比对不同物种的氨基酸序列的差异,并构建系统进化树,发现白氏文昌鱼的apoA-I基因非常不保守保。2、揭示白氏文昌鱼apoA-I在各个组织的表达情况及经LPS,POLY(I:C)处理或细菌感染后表达量变化情况:应用RT-PCR(quantitative PCR)及RealtimePCR技术检测了白氏文昌鱼生殖腺、脊索、肝脏、鳃、肠5个组织。实验结果表明,白氏文昌鱼apoA-I基因在各检测组织中均有分布,并呈现组织特异性表达,其中生殖腺中表达量最大,其次肝脏和鳃的表达量较生殖腺表达量低,apoA-I基因在肠中的表达量最低。在LPS(Lipopolysaccharides)、大肠杆菌和POLY(I:C)(polyinosinic-polycytidylic acid)感染实验中,与对照组相比,实验组的LPS和POLY(I:C)两组处理的白氏文昌鱼中的apoA-I mRNA表达量显著上升。该结果说明apoA-I可能参与到免疫应激反应中,并在文昌鱼的先天防御免疫系统中起着无比重要的作用。3、成功构建了白氏文昌鱼真核细胞分泌型表达ApoA-I的载体pCDNA6-BSA-apoA-I。另外还构建了适于在大肠杆菌中表达His-ApoA-I融合蛋白的表达质粒(pET-28a-apoA-I),并摸索出最适表达条件,得以在大肠杆菌中以可溶性蛋白的形式成功表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化后,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测的目的蛋白条带与理论值相符。经过免疫印迹验证该蛋白含有HIS标记,即为目的蛋白。4、以大肠杆菌,芽孢杆菌,7A弧菌为实验对象,将纯化的His-ApoA-I融合蛋白按不同浓度加到各菌液中,实时监测3种菌OD600的光密度吸收值,结果显示,ApoA-I蛋白对7A弧菌的生长有一定程度的抑制作用,但对大肠杆菌和芽孢杆菌的生长似乎不具影响。