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弓形虫病(Toxoplasmosis)由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)感染引起,是一种可导致人及动物流产、畸形或死胎的人兽共患寄生虫病,严重危害公共卫生安全和畜牧业生产。猫是其终末宿主,在弓形虫的传播过程中起重要作用。因此,建立快速、准确的弓形虫检测方法对人类健康具有重大意义。弓形虫致密颗粒蛋白(GRAs)是一类分泌排泄蛋白,其中GRA1与弓形虫速殖子侵染宿主细胞的信号转导有关,而GRA7在弓形虫各个时期均能分泌,是一种潜在的疫苗侯选分子。证明GRA1、GRA7作为诊断抗原具有良好的免疫原性,可作为血清学诊断弓形虫病的基因标志物。本研究利用原核表达的弓形虫致密颗粒蛋白GRA1、GRA7,建立了GRA1-ELISA与GRA7-ELISA检测方法。利用构建原核表达载体pET-28a-GRA1、pET-28a-GRA7,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE验证,重组蛋白GRA1与GRA7分子量分别为25、27 kDa;Western blotting分析表达产物,结果表明,该产物具有较强的免疫反应;应用Ni-NTA对表达蛋白进行纯化,蛋白纯度高达98%;GRA1与GRA7的浓度分别为200μg/mL和600μg/mL。利用纯化重组蛋白GRA1和GRA7分别作为诊断抗原,建立GRA1-ELISA和GRA7-ELISA检测方法。确立了GRA1、GRA7最佳抗原包被浓度5μg/mL、5μg/mL,血清一抗最佳稀释度1:64,HRP标记兔抗猫IgG二抗最佳工作浓度1:20000。试验表明GRA1-ELISA与GRA7-ELISA方法检测灵敏度高,重复性好。应用GRA1-ELISA和GRA7-ELISA方法检测旋毛虫、包虫、猪附红细胞体和猫弓形虫阳性血清,表明建立的GRA1-ELISA与GRA7-ELISA检测方法具有特异性。建立GRA1-ELISA和GRA7-ELISA检测方法以MAT/IFA法检测结果为标准进行比较评价,GRA1-ELISA检测方法假阳性率为10.8%,假阴性率为4.1%,而GRA7-ELISA检测方法假阳性率为7.5%,假阴性率为1.4%,说明GRA7为诊断抗原检测弓形虫病的假阳性率和假阴性率较低。将差异部分通过McNemar卡方检验均无显著性差异(P>0.05);将一致部分通过Kappa检验,GRA1:Kappa=0.83,结果一致率为94.6%;GRA7:Kappa=0.92,结果一致率为97.2%;表明GRA7-ELISA检测方法一致率较高。ROC曲线分析出建立的GRA7-ELISA稳定性较好。GRA1-ELISA的cut-off值为0.11时,敏感性为83.6%,特异性为87%;GRA7-ELISA的cut-off值为0.26时,敏感性为89.7,特异性为92.5%。试验表明GRA1作为诊断抗原建立GRA1-ELISA方法检测效果不明显,敏感性与特异性较低、稳定性较弱;GRA7为检测猫弓形虫病的优质诊断抗原,所建立的GRA7-ELISA检测方法具有较高的敏感性与特异性、较强的稳定性。本研究建立的GRA7-ELISA诊断方法,解决了弓形虫病不易准确、快速诊断的难题,对猫弓形虫病的临床诊断、疾病防控具有重要意义,筛选出GRA7优质诊断抗原为我国猫弓形虫病的快速诊断及试剂盒的研发提供依据。