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背景:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是恶性血液系统疾病之一,特征为白血病细胞恶性克隆性增生,我国总体发病率为3-4/10万。该类疾病存在死亡率高、复发率高的特点,并且存在较高的治疗相关死亡,是一种凶险的恶性血液疾病。化疗目前仍是治疗AML的主要手段,但耐药以及治疗相关毒性等问题依然是困扰医务人员,如何有效克服上述问题仍然是目前治疗急性髓系白血病的热点。近年来,随着研究人员对肿瘤细胞自噬的认识不断加深,越来越多的证据表明自噬现象在急性髓系白血病治疗过程中扮演了重要角色。因此进一步探索自噬相关机制将有助于在更有效的治疗急性髓系白血病治疗中取得突破。微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬标志物,自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),结合在自噬体膜上。目前有文献已报道Hela细胞自噬发生时,于形成LC3I前,存在核内LC3外移的过程,然而在急性髓系白血病细胞中是否亦存在这样的表现以及其相关机制目前尚不清楚。目的:用化疗药物阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-c)以及靶向药物索拉非尼(Sorafenib)分别作用急性髓系白血病细胞株(THP-1,MV4-11),观察其自噬发生时是核内LC3分布的改变,同时观察其调控机制中蛋白去乙酰化酶家族成员Sirt1 以及核转移蛋白(Diabetes and Obesity Regμlated gene,DOR)表达改变,并探讨其在自噬信号通路中作用以及对细胞增殖生长的影响。在此理论基础上,探讨小剂量西达本胺是否可通过抑制Sirt1表达从而抑制自噬来影响急性髓系白血病细胞株的增殖。方法:(1)Ara-c处理THP-1,Ara-c以及索拉非尼分别处理MV4-11细胞株后,使用Western-Blot技术检测细胞自噬蛋白LC3以及P62表达情况,雷帕霉素以及饥饿处理组为阳性对照组,无药物处理为阴性对照组。使用免疫荧光技术观察药物处理THP-1以及MV4-11后LC3的分布变化,以及DOR分布的改变,雷帕霉素以及饥饿处理组为阳性对照组,无药物处理为阴性对照组。利用荧光定量PCR手段检测药物处理THP-1以及MV4-11后的Sirt1,DORmmRNA的表达水平,以饥饿处理组为阳性对照组,无药物处理为阴性对照组。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)联合药物处理THP-1以及MV4-11细胞,使用免疫荧光技术检测LC3的分布变化,以及DOR分布的改变,使用荧光定量PCR手段检测Sirt1,DORmRNA的表达水平。利用荧光定量PCR手段检测药物处理急性髓系白血病患者的原代细胞后的Sirt1,DORmRNA的表达水平。(2)利用小分子RNA干扰技术下调THP-1,MV4-11细胞中的Sirt1,DORmRNA表达水平,使用Western-Blot技术检测细胞自噬蛋白LC3以及P62表达情况,使用免疫荧光技术检测LC3的分布变化,以及DOR分布的改变。同时分别利用Western-Blot技术以及荧光定量PCR检测自噬信号通路中关键调控分子的蛋白和mRNA表达的改变。(3)通过MTS,流式细胞分析方法以及Western-Blot技术分析抑制Sirt1以及DOR后对细胞增殖存活的影响。(4)在上述理论基础上,使用小剂量西达本胺处理THP-1,MV4-11细胞后,通过MTS,流式细胞分析方法,荧光定量PCR以及Western-Blot技术探讨小剂量西达本胺是否可通过影响Sirt1表达来调控自噬,从而影响对急性髓系白血病细胞株的增殖存活。结果:(1)化疗药物Ara-c以及靶向药物索拉非尼在抑制急性髓系白血病细胞生长的同时可以诱导细胞自噬增强,在自噬增强时,出现核内LC3转移到核外的改变,同时核内DOR亦出现外移的改变。其中与核内LC3外移相关的分子Sirt1以及DORmmRNA均有不同程度的上调,原代细胞经化疗药物处理后也出现Sirt1以及DORmRNA的表达上调。经3-MA抑制自噬后,核外LC3分布有减少的趋势,同时Sirt1以及DORmRNA出现下调。(2)经下调Sirt1以及DORmRNA的水平后,急性髓系白血病细胞在药物处理后的自噬有所减弱,且核内LC3外移减弱。(3)Sirt1以及DOR表达的改变可以影响自噬通路中的关键分子Beclin1,高迁移率族蛋白 1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)以及一磷酸腺苷活化的蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的表达。(4)下调细胞的Sirt1以及DOR的水平后,可增强Ara-c,索拉非尼的细胞毒性作用,促进其对白血病细胞的凋亡作用。(5)小剂量西达本胺可以通过下调白血病细胞的Sirt1抑制细胞自噬来增加细胞对Ara-c与索拉非尼的敏感性,促进药物对细胞的凋亡作用。结论:(1)核内LC3外移参与急性髓系白血病细胞化疗药物处理后产生的自噬现象,且Sirt1,DOR是核内LC3外移的调控分子。(2)核内LC3外移在自噬信号通路可影响Beclin1通路,HMGB1通路与AMPK通路。(3)通过抑制核内LC3外移达到抑制急性髓系白血病细胞的自噬可增强化疗药物的细胞毒性作用。(4)小剂量西达本胺可通过下调Sirt1水平抑制急性髓系白血病细胞自噬,从而增强相关药物的细胞毒性作用。