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山羊β-防御素104a(gBD104a)被定位于山羊附睾头上皮细胞、山羊精子头部前端顶体及精子中部的线粒体上,其可能在精子的成熟及获能等生理过程发挥重要作用。但是,目前关于gBD104a的表达调控机制尚不清楚,因此,本试验旨在研究MEK抑制剂及AR基因敲除对山羊附睾头细胞中gBD104a表达的影响。取15日龄羔羊附睾头组织剪成小块,用胰蛋白酶消化后进行培养,建立附睾头细胞系。通过对体外培养的山羊附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的17β-雌二醇(E2,0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)、二氢睾酮(DHT,10ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、320 ng/mL)及 MEK 信号通路抑制剂 PD0325901(1.0μM、2.5 μM、5.0 μM、10.0 μμM),处理48 h后用流式细胞仪检测附睾头细胞的活细胞数和凋亡细胞数。同时,收集各处理组的细胞,用荧光定量PCR和Western blotting技术检测gBD104a的mRNA和蛋白表达情况。应用CRISPR/Cas9系统构建了 3个AR基因敲除载体。通过细胞转染,检测敲除AR基因后gBD104a的表达情况。研究结果如下:(1)在附睾头细胞培养液中添加0.1 ng/mL E2处理48 h后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA的表达量显著高于空白对照组和添加100 ng/mL E2组(P<0.05)。在附睾头细胞培养液中添加160ng/mLDHT处理48h后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA的表达量显著高于空白对照组和添加10ng/mL、20ng/mL和40ng/mLDHT组(P<0.05)。(2)在含0.1 ng/mLE2的附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的PD0325901后,山羊附睾头细胞中gBD104amRNA的表达量显著低于添加0.1 ng/mL E2组gBD104a的表达量;添加0.1 ng/mLE2和1.0 μM PD0325901时,gBD104amRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05)。在附睾头细胞培养液中添加160 ng/mL DHT和5.0 μM PD0325901后,山羊附睾头细胞中gBD104a mRNA和蛋白的表达量均显著高于其它组(P<0.05)。(3)在含0.1 ng/mLE2的附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的PD0325901后,山羊附睾头细胞中活细胞的百分率显著低于添加0.1 ng/mL E2组,凋亡率显著高于空白对照组和添加0.1 ng/mL E2组(P<0.05)。在含160 ng/mL DHT的附睾头细胞培养液中分别添加不同浓度的PD0325901时,山羊附睾头细胞中活细胞的百分率显著低于空白对照组和添加160ng/mLDHT组,凋亡率显著高于只添加160ng/mLDHT组(P<0.05)。(4)用构建的3个pCas9/gRNA1 AR基因敲除载体质粒转染山羊附睾头细胞,通过荧光定量PCR和Western blotting检测细胞中AR的表达量,筛选出敲除效果最佳的载体—pCas9/gRNA1-AR-1452。用 pCas9/gRNA1-AR-1452 敲除山羊附睾头细胞AR基因后,gBD104a mRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05)。综上所述,E2和DHT都可以促进山羊附睾头细胞中gBD104a的表达。E2和DHT通过MEK信号通路调节gBD104a的表达,而且雄激素—雄激素受体途径参与调节gBD104a的表达。