储粮霉变是造成粮食减损和品质下降的重要原因之一。灰绿曲霉是典型的低水分活度下活动的腐生霉菌,常被看作储粮早期霉变的“警示菌”。研究发现,Puroindoline蛋白(简称PIN蛋白)能够有效抑制许多植物病原菌的生长,对细菌和霉菌都具有明显的抗性。本课题组前期从小麦中克隆到Pina基因并在大肠杆菌中实现了表达。本文以此原核系统中表达纯化出的重组蛋白PINA(rPINA)为研究对象,考察其对主要储粮霉菌的抑菌作用及抑菌效果稳定性,着重研究了该重组蛋白对灰绿曲霉的抑菌效果和作用方式。主要研究结果如下:研究了重组蛋白PINA对白曲霉、黑曲霉、棕曲霉、禾谷镰刀菌和链格孢霉等五种常见储粮霉菌的抑菌作用。结果显示:在PDB培养基中,0.334 mg/m L重组蛋白PINA可在12 h内完全抑制白曲霉、黑曲霉、棕曲霉和禾谷镰刀的孢子萌发,部分抑制并延迟链格孢霉的孢子萌发;以PDA为培养基,当培养时间为4 d时,0.334 mg/mL重组蛋白PINA可显著抑制上述五种霉菌的菌丝生长。其中,对黑曲霉、禾谷镰刀菌和白曲霉的抑制率分别达到73.68%、89.13%和74.5%。对黑曲霉和棕曲霉的产孢能力也表现明显的抑制效应。研究了重组蛋白PINA对灰绿曲霉孢子在CD液体培养基中萌发及菌丝在SCDA固体培养基上生长的影响。结果表明:0.09 mg/mL重组蛋白PINA可在36 h内完全抑制灰绿曲霉孢子萌发,并在培养5 d后菌丝生长的抑制率为25.32%。当浓度为0.334 mg/mL时,菌丝生长的抑制率高达80.06%。以灰绿曲霉为指示菌,研究了重组蛋白PINA的抑菌效果稳定性。结果显示:重组蛋白PINA具有较好的热稳定性,可耐受70℃处理30 min;在pH6.0-10.0的缓冲液中保持抑菌活力,但对酸性条件较为敏感;该蛋白紫外照射下稳定,在高盐环境中仍有抑菌效果,对K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+具有一定程度的耐受性,用10%的SDS及Tween-20处理后仍存在抑菌活性。重组蛋白PINA对灰绿曲霉孢子萌发表现出较好的抑制作用。扫描电镜观察发现,经0.09 mg/m L浓度的重组蛋白PINA处理24 h后,灰绿曲霉孢子结构变形,出现凹陷、破损等现象。通过将重组蛋白PINA与FITC进行偶联定位,结果显示处理时间为6 h和12 h的孢子内部均定位到重组蛋白。PI染色结果显示,孢子细胞膜出现损伤,细胞膜丧失功能。JC-1和DAPI染色结果表明,线粒体膜电位发成紊乱,呈现降低趋势;细胞核受到损伤,出现染色体聚集浓缩现象。研究了重组蛋白PINA对灰绿曲霉菌丝的作用方式。扫描电镜观察显示,0.09 mg/mL浓度的重组蛋PINA处理24 h后,菌丝出现扁平、褶皱的不良变化。FITC-rPINA定位测定表明,当培养6 h和12 h后,灰绿曲霉菌丝内均定位到重组蛋白。PI、JC-1和DAPI染色实验表明,经重组蛋白PINA处理后的菌丝细胞出现细胞膜完整性丧失、线粒体膜电位下降和DNA损伤的情况。本文确证了重组蛋白PINA对主要储粮危害性霉菌具有抑制作用和抑菌稳定性,并初步探明了重组蛋白PINA对灰绿曲霉的抑制作用方式,为将其开发成储粮防霉剂奠定了基础并提供理论依据。