DNA芯片技术是一种新的高通量DNA分析检测手段。DNA芯片把大量已知序列探针集成在基片上，通过与标记的若干靶核酸序列杂交，可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行检测和分析。DNA芯片的原位合成是制备高密度芯片的重要途径。目前，国际上仅有美国Affymetrix公司应用光脱保护DNA原位合成技术生产高密度基因芯片产品。但是，该技术尚存在制备成本高、单步合成产率低等问题。为此，我们提出了分子印章法DNA芯片原位合成技术，该技术具有操作简单、成本低、单步合成产率高等特点。本文对以高分子弹性印章为模板的DNA芯片原位合成技术进行了深入的研究，提出和优化了若干关键的压印偶联反应制备DNA芯片的工艺，为该项技术最终工业化提供了可行和坚实的基础。 1.设计和构建了高定位精度的分子印章法DNA芯片制备系统。该系统包括低水低氧的手套箱(手套箱的环境为0<,2>≤1．5×10<-4>％，H<,2>O≤2×10<-4>％，均为体积含量)、计算机控制的压印平台(平台移动范围为220毫米×290毫米×70毫米，分辩率为1微米，重复定位精度3微米)、与合成仪相连并置于手套箱中的密闭反应池，能够避免试剂间的互串，使手套箱始终保持良好的环境。这一系统达到了DNA在片合成的要求，为分子印章法制备DNA芯片提供了不可缺少的条件。 2.通过对提出的压印偶联反应和压印脱对二甲氧基三苯基(DMT)反应二种制备DNA芯片的工艺路线进行比较研究，确定了压印偶联反应为制备DNA芯片的工艺路线。用压印偶联反应合成了20mer的寡核苷酸，通过末端荧光基团法测得压印偶联反应的单步合成产率大于97％，大大高于Affymetrix光脱保护法的90％。 3.制备出高质量、高分辨、集成化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)大面积弹性体印章。首次提出了将所有印章集成在同一固相载体表面的大面积分子印章的思路，解决了使不同印章与合成用玻璃片之间压印偶联反应的准确定位问题;提出了用表面镀铝(银)玻璃板作印章母板的方法，解决了大面积PDMS印章和其母板之间的脱模问题，确保了PDMS印章完全复制出模板的图案； 提出了在玻璃板上进行甲基三氯硅烷单分子层自组装工艺，明显地改善了 PDMS印膜与玻璃基底的粘和性能，其牢固的结合可以有效控制大面积 PDMS印章的收缩与形变。当印章膜厚小于6.0×lO<-4>m，阵点高度为1.5× 10<-5>m时，PDMS印章线收缩小于0.0427％，阵点面收缩小于0.3％，完全能 够满足阵点数为65536／cm<2>微阵列制备时多次压印不错位的要求。利用上述 方法在一块0.18 m×0.26 m玻璃板上制备出168个PDMS印章。 4.研究了寡核苷酸压印偶联反应的影响因素，提高了寡核苷酸的偶联效率和反 应位点的均匀性。实验发现，在氩气保护(水和氧体积含量低于5.0×10<-4>％) 下四唑和核苷酸单体的乙腈混合液的反应活性可保持10小时以上，在工艺 上可减少核酸单体的配制次数，从而节省大量试剂；提出了应用含羟基小分 子的液体对压印偶联反应后的芯片进行处理的工艺，成功地清除了芯片上大 量剩余的活性核酸单体分子，解决了它们对临近点阵可能产生的污染问题； 用6％三氯乙酸／甲苯作为脱保护试剂，可以减少在密闭反应池中气泡的形成，以确保DNA芯片制备过程中反应液与玻璃载片的充分接触：在寡核苷 酸微阵列制备过程中舍弃了通常DNA固相合成工艺中的封闭反应步骤，有 效地提高了DNA芯片的制备效率。 5.探讨了手臂分子对寡核苷酸合成及杂交的影响。通过与其它手臂分子得到的 结果比较，玻璃基片通过5％的3-缩水甘油．环氧丙基-三甲氧基硅烷水溶液、 10％乙二胺的水溶液、5％戊二醛的磷酸盐缓冲溶液、10％乙醇胺的水溶液和 硼氢化钠还原组装的手臂分子上得到了合成20 met寡核苷酸的最大荧光强 度。实验研究证实了手臂分子的空间效应、亲水性等性质对寡核苷酸合成和 杂交存在影响；在进行玻璃基片的修饰时，施加超声波有利于反应的均匀性。 6.通过上述工艺的研究，我们成功地应用分子印章技术制备出高密度DNA芯 片。获得了点阵数为64K／cm<2>的相同序列的寡核苷酸微阵列芯片，各阵点上 寡核苷酸的杂交荧光强度基本一致；制备出点阵数为2500／cm<2>的不同序列的 寡核苷酸微阵列，通过与靶序列杂交，成功地获得了预想的结果，实现了单 个碱基错配的检测。