论文部分内容阅读
目的：
基于网络药理学与分子对接的研究方法分析预测七宝美髯丹延缓皮肤光老化的作用网络和通路机制，并运用细胞实验及动物实验验证上述作用机制及信号通路，从微观到宏观证实七宝美髯丹对抗皮肤光老化有效性。
方法：
1.利用TCMSP及TCMID数据库筛选七宝美髯丹活性成分及作用靶点，联合GeneCards、NCBI Gene数据库获取皮肤光老化相关靶基因，基于Cytoscape软件构建药物-化合物-作用靶点网络，STRING数据库进行PPI核心蛋白互作分析，Cytoscape软件中的MCODE插件对核心蛋白的生物功能进行聚类分析，利用DAVID数据库对64个核心靶点基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，最后使用Autodock Vina、Python和Pymol软件进行分子对接，
2.为验证七宝美髯丹对抗皮肤光老化的有效性以及氧化应激、胶原代谢的作用机制，采用七宝美髯丹含药血清处理的衰老的人真皮成纤维细胞(NHSF)，观察细胞形态及SA-β-gal活性，判断七宝美髯丹对人真皮成纤维细胞光老化的保护作用，Western-bolt法检测人真皮成纤维细胞（NHSF）中炎症氧化应激相关的肿瘤坏死因子（TNF-α）和胶原相关的基质金属蛋白酶（MMP-1）的蛋白表达水平，明确氧化应激和胶原代谢途径，以及TNF信号通路中的MAPK/NF-?B和PI3K/AKT信号在皮肤光老化的作用，验证网络药理学的分析预测结果。
结果：
1.获得七宝美髯丹有效活性成分70个，作用靶点273个，皮肤光老化相关靶基因234个，交集核心靶点64个，GO富集分析得到生物过程条目393个，在氧化应激，细胞凋亡，脂质代谢，血管生成等生物过程中基因较富集，KEGG分析以TNF信号通路为代表，其中MAPK/NF-κB signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway作用突出，核心靶点TNF、MAPK1、PTGS2、AKT1等在此富集，控制皮肤衰老的基因表达过程。分子对接结果显示，七宝美髯丹活性成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大豆黄素与核心靶蛋白AKT1、TNF、PTGS2、MAPK1分子对接结合最佳，构象稳定。
2.七宝美髯丹含药血清处理衰老的人真皮成纤维细胞（NHSF），结果显示模型组细胞排列不规则，细胞变平、变大，出现空泡，轮廓不清楚，折光性能差，符合衰老的细胞学形态特征；七宝美髯丹组的细胞形态一致，呈长梭形，轮廓较清楚，折光性能较好。SA-β-gal活性方面，正常组SA-β-gal染色阳性率为（2.78%±0.22%），空白组为（2.83%±0.29%）；模型组为（37.58%±2.56%），七宝美髯丹组为（24.55%±1.74%）。模型组分别与正常组、空白组比较SA-β-gal染色阳性率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；七宝美髯丹组与模型组比较，SA-β-gal染色阳性率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
进一步观察人真皮成纤维细胞（NHSF）中TNF-α、MMP1蛋白的表达水平，结果显示，模型组分别与正常组、空白组比较，TNF-α和MMP-1的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；七宝美髯丹组较模型组TNF-α和MMP-1的表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），各组NHSF中TNF-α和MMP-1蛋白的表达模型组分别与正常组、空白组比较，TNF-α和MMP-1的表达水平明显上升；七宝美髯丹组较模型组TNF-α和MMP-1的表达水平明显下降。
结论：
（1）七宝美髯丹可能通过药物核心成分（槲皮素、山奈酚、异鼠李素等）与核心靶点（AKT1、TNF、PTGS2、MAPK1）相结合，调节TNF信号通路中MAPK/NF-κB以及PI3K/AKT信号的表达，继而抑制细胞凋亡、促进血管新生，影响氧化应激，调节胶原代谢，延缓皮肤光老化。
（2）实验表明，七宝美髯丹对人真皮成纤维细胞（NHSF）的光老化具有明显的保护作用，可调节细胞的氧化应激损伤和胶原代谢进程，下调皮肤肿瘤坏死因子TNF-α、基质金属蛋白酶MMP1的蛋白表达水平，影响TNF信号通路中MAPK/NF-κB和PI3K/AKT信号的传导，从而延缓皮肤光老化，本研究对前期网络药理学的分析结果进行了实验验证，证实了七宝美髯丹延缓皮肤光老化的部分作用机制。
基于网络药理学与分子对接的研究方法分析预测七宝美髯丹延缓皮肤光老化的作用网络和通路机制，并运用细胞实验及动物实验验证上述作用机制及信号通路，从微观到宏观证实七宝美髯丹对抗皮肤光老化有效性。
方法：
1.利用TCMSP及TCMID数据库筛选七宝美髯丹活性成分及作用靶点，联合GeneCards、NCBI Gene数据库获取皮肤光老化相关靶基因，基于Cytoscape软件构建药物-化合物-作用靶点网络，STRING数据库进行PPI核心蛋白互作分析，Cytoscape软件中的MCODE插件对核心蛋白的生物功能进行聚类分析，利用DAVID数据库对64个核心靶点基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，最后使用Autodock Vina、Python和Pymol软件进行分子对接，
2.为验证七宝美髯丹对抗皮肤光老化的有效性以及氧化应激、胶原代谢的作用机制，采用七宝美髯丹含药血清处理的衰老的人真皮成纤维细胞(NHSF)，观察细胞形态及SA-β-gal活性，判断七宝美髯丹对人真皮成纤维细胞光老化的保护作用，Western-bolt法检测人真皮成纤维细胞（NHSF）中炎症氧化应激相关的肿瘤坏死因子（TNF-α）和胶原相关的基质金属蛋白酶（MMP-1）的蛋白表达水平，明确氧化应激和胶原代谢途径，以及TNF信号通路中的MAPK/NF-?B和PI3K/AKT信号在皮肤光老化的作用，验证网络药理学的分析预测结果。
结果：
1.获得七宝美髯丹有效活性成分70个，作用靶点273个，皮肤光老化相关靶基因234个，交集核心靶点64个，GO富集分析得到生物过程条目393个，在氧化应激，细胞凋亡，脂质代谢，血管生成等生物过程中基因较富集，KEGG分析以TNF信号通路为代表，其中MAPK/NF-κB signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway作用突出，核心靶点TNF、MAPK1、PTGS2、AKT1等在此富集，控制皮肤衰老的基因表达过程。分子对接结果显示，七宝美髯丹活性成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素、大豆黄素与核心靶蛋白AKT1、TNF、PTGS2、MAPK1分子对接结合最佳，构象稳定。
2.七宝美髯丹含药血清处理衰老的人真皮成纤维细胞（NHSF），结果显示模型组细胞排列不规则，细胞变平、变大，出现空泡，轮廓不清楚，折光性能差，符合衰老的细胞学形态特征；七宝美髯丹组的细胞形态一致，呈长梭形，轮廓较清楚，折光性能较好。SA-β-gal活性方面，正常组SA-β-gal染色阳性率为（2.78%±0.22%），空白组为（2.83%±0.29%）；模型组为（37.58%±2.56%），七宝美髯丹组为（24.55%±1.74%）。模型组分别与正常组、空白组比较SA-β-gal染色阳性率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；七宝美髯丹组与模型组比较，SA-β-gal染色阳性率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
进一步观察人真皮成纤维细胞（NHSF）中TNF-α、MMP1蛋白的表达水平，结果显示，模型组分别与正常组、空白组比较，TNF-α和MMP-1的表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；七宝美髯丹组较模型组TNF-α和MMP-1的表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），各组NHSF中TNF-α和MMP-1蛋白的表达模型组分别与正常组、空白组比较，TNF-α和MMP-1的表达水平明显上升；七宝美髯丹组较模型组TNF-α和MMP-1的表达水平明显下降。
结论：
（1）七宝美髯丹可能通过药物核心成分（槲皮素、山奈酚、异鼠李素等）与核心靶点（AKT1、TNF、PTGS2、MAPK1）相结合，调节TNF信号通路中MAPK/NF-κB以及PI3K/AKT信号的表达，继而抑制细胞凋亡、促进血管新生，影响氧化应激，调节胶原代谢，延缓皮肤光老化。
（2）实验表明，七宝美髯丹对人真皮成纤维细胞（NHSF）的光老化具有明显的保护作用，可调节细胞的氧化应激损伤和胶原代谢进程，下调皮肤肿瘤坏死因子TNF-α、基质金属蛋白酶MMP1的蛋白表达水平，影响TNF信号通路中MAPK/NF-κB和PI3K/AKT信号的传导，从而延缓皮肤光老化，本研究对前期网络药理学的分析结果进行了实验验证，证实了七宝美髯丹延缓皮肤光老化的部分作用机制。