目的:左归丸是防治绝经后骨质疏松症的经典方剂,本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术对左归丸3种提取方法化学成分进行定性及相对定量分析,在PMOP大鼠BMSCs增殖率药效学差异评价的基础上,优选提取方法,探讨左归丸的药效物质基础,并试图从代谢组学的角度及TGF-β/Smad信号通路的为切入点探讨左归丸水提液和醇提液对PMOP大鼠BMSCs成骨分化的作用机制。材料与方法:SPF级2月龄雌性未生育SD大鼠60只,自由摄食饮水,适应性喂养1周后标号并称重。选取6只大鼠采取双侧卵巢切除术制备PMOP大鼠模型,1周后,将大鼠脱颈处死取双侧股骨及胫骨BMSCs细胞,培养至第4代用于实验。MTT法检测左归丸3种提取方法体外干预PMOP大鼠BMSCs增殖的影响,根据分析结果,筛选2种最佳提取方法进行后续体内实验。将余下54大鼠按随机数字表法进行分组,分为空白对照组6只和手术组48只,手术组大鼠采取双侧卵巢切除术制备PMOP模型,按体重分层随机分为以下8组:模型组(OVX)、补佳乐组(BJL)、水提取组高剂量组(GS)、水提取组中剂量组(ZS)、水提取组低剂量组(DS)、醇提取高剂量组(GC)、醇提取中剂量组(ZC)、醇提取低剂量(DC),每组实验动物各6只。术后7d后按每kg体重大鼠的给药量为人的6.3倍计算,空白对照组、模型组灌服等量蒸馏水,其余各组分别灌服相应制备好的药液,术后一周开始给药,每日灌胃1次,灌服12周。各高剂量组分别于末次给药15 min、30 min、1 h、2h后采用大鼠眶静脉取血收集血清样品,采用UPLC-Q-TOF-MS技术检测化学成分。余下大鼠采用腹主动脉采血分离血清,采用UPLC-Q-TOF-MS技术,对左归丸抗去卵巢大鼠骨质疏松症开展代谢组学研究。分离双侧股骨及胫骨提取BMSCs细胞,培养至第4代用于实验,采用MTT法检测左归丸2种最优提取方法不同剂量对大鼠BMSCs增殖的影响,PNPP法检测BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性,优选最优给药剂量用于后续试验。SPF级2月龄雌性未生育SD大鼠40只,自由摄食饮水,适应性喂养1周按随机数字表法进行分组,分为空白对照组8只和手术组32只,手术组大鼠采取双侧卵巢切除术制备pmop模型,按体重分层随机分为以下4组:模型组(ovx)、补佳乐组(bjl)、左归丸水提取优剂量组(zgs)、左归丸醇提取优剂量组(zgc),每组实验动物各8只。术后7d补佳乐组按每kg体重大鼠的给药量为人的6.3倍计算,左归丸各组灌服优选剂量,空白对照组、模型组灌服等量蒸馏水,其余各组分别灌服相应制备好的药液,每日灌胃1次,灌服12周,处死,分离双侧股骨及胫骨提取bmscs细胞,培养至第4代用于实验。采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶(alp)活性,茜素红法观察矿化结节的形成,采用realtimert-pcr法检测各组bmscsrunx2、collageni、pparγ、c/ebpα、c/ebpβmrna表达水平,采用westernblotting法检测各组bmscsrunx2、collageni、pparγ、c/ebpα、c/ebpβ、tgfβ1、tβrⅠ、tβrⅡ、smad2、smad3、smad4蛋白表达水平。结果:1左归丸不同提取方法干预pmop大鼠bmscs成骨诱导的物质基础研究1.1水提法左归丸所含化合物质谱分析经一、二级质谱解析,通过相关数据库查询、文献调研等手段,初步在左归丸水提液中共找到熟地黄、菟丝子、牛膝、枸杞子、山药、山茱萸等药材的化学成分及可能的地黄苷a、十二烷、牛膝皂苷Ⅱ、牛膝皂苷Ⅰ、东莨菪素、山奈酚、马钱苷酸、金丝桃苷、紫云英苷等51个化合物。1.2醇提法左归丸所含化合物质谱分析经一、二级质谱解析,通过相关数据库查询、文献调研等手段,初步在左归丸醇提液中共找到熟地黄、菟丝子、牛膝、枸杞子、山药、山茱萸等药材及可能的地黄苷a、亚油酸、七叶内酯、油酸、十二烷、牛膝皂苷Ⅱ、牛膝皂苷Ⅰ、东莨菪素、山奈酚、马钱苷酸、山茱萸新苷等62个化合物。1.3水提醇沉法左归丸水溶液所含化合物质谱分析经一、二级质谱解析,通过相关数据库查询、文献调研等手段,初步在水提醇沉法左归丸水溶液中共找到熟地黄、菟丝子、牛膝、枸杞子、山药、山茱萸等药材及可能的地黄苷a、亚油酸、七叶内酯、油酸、十二烷、牛膝皂苷Ⅱ、牛膝皂苷Ⅰ、东莨菪素、山奈酚、马钱苷酸、山茱萸新苷等60个化合物,采用质谱相对定量分析方法,得到左归丸3种不同提取方法溶液中差异化合物成分及相对含量。1.4bmscs流式细胞仪鉴定经流式细胞仪检测,cd11b/c(4.9%)、cd45(5.1%)表达为阴性,cd90(64.5%)、cd29(94.6%)表达为阳性。1.5bmscs生长曲线bmscs生长曲线大体呈s形,接种后第1-2d为潜伏期,从第3d开始bmscs增殖并进入对数生长期,第4-5d达到高峰,以后进入平台期。1.6左归丸3种提取方法体外干预pmop大鼠bmscs增殖作用结果显示:左归丸3种提取方法及不同浓度对bmscs细胞增殖作用具有不同影响。浓度为25mg/ml时,3种提取方法对细胞抑制率较高,各组间无统计学意义(p>0.05);2.5mg/ml,0.025mg/ml,0.0025mg/ml浓度时,不同提取方法对细胞抑制率组间比较无统计学意义(p>0.05);0.25mg/ml时,水提法和醇提法对细胞抑制率较低,水提法和醇提法比较,水提醇沉水溶和水提醇沉醇溶组细胞抑制率显著升高(p<0.01)。0.25mg/ml时,水提法和醇提法对细胞抑制率最低。1.7左归丸水提液、醇提液对pmop大鼠bmscs增殖的影响结果显示:灌胃给予pmop大鼠左归丸水提取液、70%乙醇提取液,对pmop大鼠bmscs促增殖作用呈时效相关性。在第1d和第3d时,与control组比较,ovx组增殖率显著降低(p<0.05),与ovx组比较,bjl,zs,zc组细胞增殖水平显著升高(p<0.05)。第5d和第7d时,与control组比,ovx组增殖率显著降低(p<0.05),与ovx组比较,bjl,zs,zc组细胞增殖水平显著升高(p<0.05),gs,ds,gc,dc组细胞增殖水平明显升高(p<0.01),zs组和zc组与bjl组比较无显著性差异(p>0.05)。1.8左归丸水提液、醇提液对pmop大鼠bmscsalp活性的影响以pnpp法检测pmop大鼠bmscsalp活性,各组在7d时alp活性最高,且加药各组在7d时alp活性均高于其他时间。左归丸水提液、70%乙醇提取液不同剂量组和bjl组alp活性在4个时间段与control、ovx组比较均有显著性提高(p<0.05);以zs和zc组alp活性升高最为明显,且zs优于zc。2.灌胃给予大鼠左归丸水提取、70%乙醇提取液血清化学成分分析灌胃给予大鼠左归丸水提取液,于15min、30min、1h、2h分别取血,血清中均能检测出金丝桃苷和山奈酚;灌胃给予左归丸70%乙醇提取液后,15min、30min、1h、2h血清中均能检测出金丝桃苷和绿原酸。3.基于代谢组学对左归丸抗pmop大鼠骨质疏松症作用机制研究基于差异内源性物质indoleacetaldehyde与色氨酸相互转化,色氨酸是体内5-羟色胺(5-ht)的前体,5-ht与骨形成与骨吸收有着密切的联系,给药组5-ht含量增加,左归丸抗pmop大鼠骨质疏松症与其增加骨形成,限制骨吸收有关。实验结果显示,给药组retinylester的含量降低,retinylester可与维生素a相互转化,可减缓维生素a对骨的破坏作用。alpha-cehc是维生素e的代谢物,在骨骼内部,制造骨骼的成骨细胞和破坏并吸收骨骼的破骨细胞均衡发挥作用,从而使骨骼保持正常新陈代谢。实验结果显示:给药组大鼠alpha-cehc水平明显下降,维生素e含量降低,减少对骨骼的破坏,发挥药效。4.左归丸水提液和醇提液对pmop大鼠bmscs成骨诱导及分化的影响4.1左归丸水提液和醇提液对pmop大鼠bmscsalp表达的影响结果显示:改良钙钴法染色后,棕黑色颗粒聚集在一起。与con组相比,ovx组细胞棕色颗粒沉积减少显著,其余各组细胞密度加强,细胞突出变长,且数量增多,棕褐色沉积物增多。4.2左归丸水提液和醇提液对pmop大鼠bmscs矿化结节的影响结果显示:成骨诱导14d,0.1%茜素红-tris-hcl37℃孵育后可观察到矿化结节明显,且呈红色。与con组相比,ovx组结节明显减少,且红色较暗,bjl、zgs和zgc组矿化结节明显增多。4.3左归丸水提液和醇提液干预pmop大鼠bmscsrunx2mrna及蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,bjl和zgs组runx2mrna表达显著上调(p<0.05),zgc组runx2蛋白表达显著下调(p<0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组runx2mrna表达显著上调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组runx2mrna表达显著下调(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,runx2mrna表达显著下调(p<0.05)。与control组相比,其余各组runx2蛋白表达显著下调(p<0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组runx2蛋白表达显著上调(p<0.05);与zgs组相比,runx2蛋白表达zgc组显著下调(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,runx2蛋白表达显著下调(p<0.05)。4.4左归丸水提液和醇提液干预pmop大鼠bmscscolⅠmrna及蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx和zgc组colⅠmrna表达显著上调(p<0.05),其余各组无显著统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs组colⅠmrna表达显著上调(p<0.05),zgc组无显著统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,colⅠmrna表达显著下调(p<0.05)。与control组相比,ovx组colⅠ蛋白表达显著下调(p<0.05),其余各组无显著统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组colⅠ蛋白表达显著上调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组colⅠ蛋白表达显著下调(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,colⅠ蛋白表达显著下调(p<0.05)。4.5左归丸水提液和醇提液干预pmop大鼠bmscspparγmrna及蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、bjl、zgs和zgc组pparγmrna表达显著上调(p<0.05);与ovx组相比,其余各组无显著统计学差异(p>0.05);与zgs组相比,zgc组无显著统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,pparγmrna表达无显著统计学差异(p>0.05)。与control组相比,ovx组pparγ蛋白表达显著上调(p<0.05),其余各组无显著统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组pparγ蛋白表达显著下调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组无显著统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,pparγ蛋白表达无显著统计学差异(p>0.05)。4.6左归丸水提液和醇提液干预pmop大鼠bmscscebpαmrna及蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx组c/ebpαmrna表达显著上调(p<0.05),其余各组无显著统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl和zgs组c/ebpαmrna表达显著下调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组无显著统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,c/ebpαmrna表达显著上调,差异有统计学差异(p<0.05)。与control组相比,ovx、zgs和zgc组c/ebpα蛋白表达显著上调(p<0.05),bjl组无显著的统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs组c/ebpα蛋白表达显著下调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组c/ebpα蛋白表达显著上调(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,c/ebpα蛋白表达显著上调(p<0.05)。4.7左归丸水提液和醇提液干预pmop大鼠bmscscebpβmrna及蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx组c/ebpβmrna表达显著上调(p<0.05),其余各组无显著统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl和zgs组c/ebpβmrna表达显著下调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组无显著统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,c/ebpβmrna表达无显著统计学差异(p>0.05)。与control组相比,ovx和zgc组c/ebpβ蛋白表达显著上调(p<0.05),bjl和zgs组无显著的统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组c/ebpβ蛋白表达显著下调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组c/ebpβ蛋白表达显著上调(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,c/ebpβ蛋白表达显著上调(p<0.05)。4.8左归丸水提液和醇提液通过tgf-β1/smads信号通路对pmop大鼠bmscstgf-β1蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、bjl和zgs组tgf-β1蛋白表达显著下调(p<0.05),zgc组无显著的统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs组tgf-β1蛋白表达显著上调(p<0.05),zgc组无显著的统计学差异(p>0.05);与zgs组相比,zgc组tgf-β1蛋白表达无显著的统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,tgf-β1蛋白表达显著下调(p<0.05)。4.9左归丸水提液和醇提液通过tgf-β1/smads信号通路对pmop大鼠bmscstβrⅠ蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、zgc组tβrⅠ蛋白表达显著下调(p<0.05),bjl、zgs组无显著的统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs组tβrⅠ蛋白表达显著上调(p<0.05),zgc组无显著的统计学差异(p>0.05);与zgs组相比,zgc组tβrⅠ蛋白表达无显著的统计学差异(p>0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,tβrⅠ蛋白表达显著下调(p<0.05)。4.10左归丸水提液和醇提液通过tgf-β1/smads信号通路对pmop大鼠bmscstβrⅡ蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、bjl、zgs和zgc组tβrⅡ蛋白表达显著下调(p<0.05);与ovx组相比,bjl、zgs组tβrⅡ蛋白表达显著上调(p<0.05),zgc组无显著的统计学差异(p>0.05);与zgs组相比,zgc组tβrⅡ蛋白表达显著下调(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,tβrⅡ蛋白表达下调无显著的统计学差异(p>0.05)。4.11左归丸水提液和醇提液通过tgf-β1/smads信号通路对pmop大鼠bmscssmad2蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、zgs和zgc组smad2蛋白表达显著下调(p<0.05),bjl组无显著的统计学差异(p>0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组smad2蛋白表达显著上调(p<0.05);与zgs组相比,zgc组smad2蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,smad2蛋白表达显著下调(p<0.05)。4.12左归丸水提液和醇提液通过tgf-β1/smads信号通路对pmop大鼠bmscssmad3蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、bjl、zgs和zgc组smad3蛋白表达显著下调(p<0.05);与ovx组相比,bjl、zgs和zgc组调smad3蛋白表达显著上(p<0.05);与zgs组相比,zgc组smad3蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,smad3蛋白表达显著下调(p<0.05)。4.13左归丸水提液和醇提液通过tgf-β1/smads信号通路对pmop大鼠bmscssmad4蛋白表达的影响结果显示:与control组相比,ovx、bjl、zgs和zgc组smad4蛋白表达显著下调(p<0.05);与ovx组相比,bjl、zgs组显著上调smad4蛋白表达(p<0.05),zgc组无显著统计学差异(p>0.05);与zgs组相比,zgc组smad4蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(p<0.05)。在加入sb431542后,与未加sb431542相比,smad4蛋白表达显著下调(p<0.05)。结论:1.左归丸3种不同提取方法化合物成分差异性不大,含量有显著差别,差异性成分及含量可能与其药效作用差异有关。2.左归丸水提液和醇提液均能促进pmop大鼠bmscs增殖,均可提高pmop大鼠bmscsalp活性,而且以左归丸水提液和醇提液中剂量组最优。3.大鼠灌服水提取左归丸后血清中可检出原型入血成分金丝桃苷和山奈酚;乙醇提取液可检出金丝桃苷和绿原酸。4.基于代谢组学研究,左归丸抗pmop大鼠骨质疏松症作用机制与色氨酸代谢及视黄醇代谢通路有关。5.左归丸水提液和醇提液可通过调控TGF-β1/Smads信号通路诱导PMOP大鼠BMSCs成骨分化,并抑制其成脂分化;其中以左归丸水提液干预该信号通路调控成骨分化作用为优。