口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,对猪牛羊等家畜和许多野生动物危害严重。近年来,在一些曾经没有爆发过的国家或地区频繁爆发,造成巨大经济损失的同时给世界人们带来极大的恐慌。灭活疫苗对口蹄疫的防控起了一定作用,但其弊端也不容忽视,研制一种价廉、安全、有效、广谱性高、易于推广的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。近年来,人们对口蹄疫疫苗及其相关的研究工作主要从两方面开展,一方面是对口蹄疫病毒抗原表位的研究,已经在VP1除外的其他结构和非结构蛋白上发现了某些确实能引起淋巴细胞扩增、加强体液免疫的肽段;另一方面是探索一种廉价、安全、使用方便的疫苗生产系统来生产口蹄疫疫苗,口蹄疫可饲疫苗在这个时代“应运而生”。本研究主要分为两个部分,第一部分是以优良的热带牧草柱花草为受体,进行O型口蹄疫病毒外壳蛋白VP1基因的转基因研究,以期探索使用柱花草(Stylosanthes spp.)生产口蹄疫可饲疫苗的可行性;第二部分是合成抗原基因,借助植物病毒表达载体以不同的融合方式表达,研究各自的抗原性。主要进行如下工作:第一部分:以柱花草为受体的口蹄疫可饲疫苗的研究。1.优化热研2号柱花草的转化体系:通过柱花草(Stylosanthes spp.)遗传转化过程中预培养时间、农杆菌(Agrobacterium)侵染浓度、乙酰丁香酮、植物组织浸提液、脯氨酸、硝酸银和农杆菌浸入法对农杆菌、外植体及共培养基的处理,研究了提高柱花草基因转化率的方法。实验结果为:用预培养2 d处理外植体,10μmol/L乙酰丁香酮和稀释5倍的番木瓜(Carica papaya L.)浸提液预处理农杆菌,1.5 mg/L的脯氨酸处理共培养基及采用农杆菌浸入法侵染外植体可以明显地提高柱花草的转化率;对农杆菌进行稀释,用柱花草浸提液预处理农杆菌及硝酸银处理共培养基对转化率无明显的影响。用SAS软件进行2×2的卡平方(x2)检验在最佳条件下的遗传转化表明:子叶和真叶的出芽率与对照相比差异都达到极显著。2.构建植物表达及目的基因转化柱花草:通过酶切、连接、转化将O型口蹄疫病毒VP1基因连接在植物中间表达载体上,构建中间表达载体pBIVP1,CaCl2法转化农杆菌LBA4404,用斑点杂交筛选农杆菌阳性转化株,得农杆菌工程菌种pBIVP1/LBA4404。农杆菌工程菌在优化的转化体系下侵染转化热研2号柱花草无菌苗的子叶叶盘。3.与泛素融合的口蹄疫VP1蛋白多克隆抗体的制备:采用PCR技术从哥伦比亚拟南芥中扩增泛素(Ubiquitin)基因,经克隆及序列测定正确后与O型口蹄疫的VP1基因一起亚克隆到原核表达载体pET30a中,构建成VP1基因的N-端融合泛素基因、C-端带6 His-tag的融合表达载体。表达载体CaCl2法转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),PCR筛选阳性克隆。工程菌经1mmol/L IPTG在28℃诱导4个小时,目标产物主要以包涵体的形式存在,洗涤、溶解包涵体,在含8 mol/L尿素的变性缓冲液中过镍鏊合亲和层析柱纯化,目标蛋白约占菌体总蛋白的54.6%。纯化的蛋白分四次免疫新西兰大白兔,琼脂糖双相电泳测定多克隆抗体的效价达1:64。4.转基因植株的分子检测:侵染柱花草子叶叶盘,过愈伤、出芽和生根等一系列的过程及卡那霉素的筛选,得到抗性植株。对抗性植株进行PCR、PCR-Southern blotting、Southern blotting、RT-PCR、Northern blotting及以制备的多克隆抗体为一抗的Western blotting检测,得到4个表达目的蛋白的转基因株系的T1代。间接ELISA法测定目的蛋白的浓度为可溶性蛋白(TSP)的0.05‰～5‰,并且T1代的遗传稳定性分析显示符合孟得尔遗传规律。5.转基因柱花草免疫昆明小白鼠:取蛋白表达量最高的转基因株系及非转基因株系(阴性对照)的全株,在45℃的烘箱中烘干,再打碎成草粉,作为饲料添加剂与淀粉和一定量的蜂蜜一起饲喂昆明小白鼠,分四次免疫,同时以纯化的融合蛋白溶液口服免疫小鼠(阳性对照)。每次免疫后的第10天采血,最后一次免疫后的第10天采用心脏放血。取各次采血的血清进行ELISA检测表明转基因柱花草能引起动物免疫反应,产生特异性抗体,抗体的效价达1:64。第二部分:口蹄疫多抗原表位基因组合表达的抗原性分析。1.各抗原表位基因的获得:分别合成5个T表位基因(A型口蹄疫3A蛋白上的21～35aa位氨基酸,A、O型口蹄疫3C蛋白上保守的196～210aa位氨基酸,O型口蹄疫VP2蛋白上的49～68 aa位氨基酸,O型口蹄疫VP3蛋白上的81～100aa位氨基酸,O型口蹄疫VP4蛋白上的20～40aa位氨基酸)及两个B表位基因(A型口蹄疫VP1蛋白上的138～160aa位氨基酸,O型口蹄疫VP1蛋白上的137～160aa位氨基酸)的单链,用Klenow酶将其延伸成双链。2. T、B表位分别融合基因及O型FMDV VP1基因的获得:合成各表位基因的引物,用于基因的融合和载体构建。采用套叠PCR技术,分四次PCR反应将5个T表位基因融合在一起,命名为T;分两次PCR将两个B表位融合在一起,命名为B。根据O型FMDV VP1基因的序列及病毒表达载体上的酶切位点设计特异引物,PCR扩增,得VP1基因片段。对T、B及VP1基因分别克隆、测序分析,获得与设计完全一致的基因序列。3.不同融合方式的中间载体的构建:采用AvaⅢ、PstⅠ这对同尾酶的酶切、连接性质,分别经三次在克隆载体上酶切、连接反应,构建不同融合方式的中间载体pMD-T-B-T、pMD-T-T-B、pMD-B-T-T。4.植物病毒表达载体的构建:通过对中间载体的酶切及与分别马铃薯X病毒载体(PVX)的连接、转化及菌落PCR鉴定和酶切鉴定,得中间表达载体PVX-T、PVX-B、PVX-T-B-T、PVX-T-T-B、PVX-B-T-T、PVX-VP1。中间表达载体分别用电激转化法转化农杆菌GV3301+PLICSa,PCR鉴定阳性转化株。5.携带各抗原基因的农杆菌工程菌种侵染烟草及RT-PCR检测:采用渗透法侵染烟草,RT-PCR检测各表位基因均在烟草中得以转录。6.各表位组合表达的抗原性分析:分别提取各侵染株叶片的总蛋白,将其稀释到相同浓度,分别以A、O型口蹄疫病毒灭活全株的标准血清为一抗进行间接ELISA检测。结果表明,不同的方式组合在抗原性上存在一定的差异,以T-B-T的融合方式最高,B-T-T次之,再是T-T-B;但都高于VP1基因的表达产物,更高于T、B融合表位的单独表达产物。