研究目的及背景结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,据国家癌症中心报道2015年我国CRC预期发病率和死亡率居全部肿瘤第五位。大多数结肠癌患者出现临床症状就诊时多已处于中晚期,而对于晚期患者,目前临床的治疗方法(手术,放疗和化疗)常伴发严重的不良反应,患者生存质量较差,而且其五年生存率仅有5%,临床急需新的治疗方法。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种很有前景的肿瘤局部消融治疗手段,具有高效、副作用小、可重复、可联合治疗等优点。PDT治疗CRC还有其他优势:愈合过程中不会导致胶原破坏,进而避免瘢痕性狭窄,可明显提高患者的生存质量,并延长其生存期,在晚期CRC的治疗方面具有较好的前景。该技术包含三大要素:光敏剂(photosensitizer,PS)、特定波长的激发光和分子氧,其中光敏剂的研发一直是PDT研究的热点。1996年Photofrin(PF)被美国FDA批准上市,作为第一个抗癌光敏剂,PF在食管癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌等数十类肿瘤数万例患者治疗中取得了良好的效果,为中晚期尤其是不适宜或者不愿采用传统肿瘤疗法的患者提供了新的治疗手段。但PF在临床应用中存在皮肤光毒性大、有效成分不明等问题,而且价格昂贵,我国临床尚未应用。因此,开发新型高效低毒、具有我国自主知识产权的光敏剂具有重大意义。我国研究人员对PF进行了系统研究,成功制备出工业化产率较高、较易纯化、水溶性较好的华卟啉钠(sinoporphyrin sodium,DVDMS);与PF相比,DVDMS有效成分明确,含量高达98%,质量标准可控,有效剂量仅需前者的约1/10,治疗完成后所需避光时间大大减小。该研究成果获得了发明专利,拥有我国自主知识产权,已获取化学药品注册分类1.1类新药临床研究批件,有望用于晚期食管癌等肿瘤的治疗,目前已进入I期临床试验阶段。作为细胞的一种防御机制,自噬广泛参与生理及病理过程。部分研究发现,抗肿瘤治疗中,自噬可帮助肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞逃避不良的治疗刺激,导致肿瘤治疗效果下降以及肿瘤耐药。自噬抑制剂联合化疗药,可在一定程度上克服肿瘤的耐药性,增强肿瘤化疗效果,部分临床试验已取得实质性进展。研究表明,PDT可诱导肿瘤细胞发生凋亡和自噬,而且自噬在PDT治疗肿瘤的过程中发挥的作用,可能因细胞的类型、光敏剂的种类及剂量等因素而不同。DVDMS作为一种新研发的光敏剂,目前相关报道比较有限,并且未见2 DVDMS-PDT诱导肿瘤自噬方面的报道。本课题拟从DVDMS-PDT体内外对结直肠癌诱导凋亡和自噬、以及自噬对抗肿瘤效果的影响进行研究,探讨DVDMS在结直肠癌治疗方面的效果和自噬在其中的发挥的作用,以期为结直肠癌的临床治疗提供参考和理论基础。研究方法与结果第一部分:实验主要采用CCK-8法、形态学观察、克隆形成、流式细胞术检测等方法研究了DVDMS-PDT对人结肠癌HCT116细胞的作用;通过HCT116细胞裸鼠移植瘤模型和HE染色等方法对体外相关研究结果进行了验证。体内外实验结果显示:DVDMS-PDT对人结肠癌具有良好的抑制作用;在相同条件下,其诱导凋亡、抑制克隆形成和体内抗肿瘤作用显著优于PF-PDT。在此基础之上,通过形态学观察、流式细胞术检测、Western blot、MDC染色、透射电镜观察、TUNEL和免疫组化从诱导凋亡和自噬两方面对DVDMS-PDT抗结肠癌的作用机制进行了研究。结果显示,DVDMS-PDT可通过诱导凋亡发挥抗肿瘤作用,而且该过程中同时诱导发生自噬。第二部分:在第一部分机制研究结果的基础之上,进一步研究了自噬在该过程中发挥的作用以及抑制自噬对DVDMS-PDT处理的HCT116细胞凋亡情况的影响,并通过HCT116细胞裸鼠移植瘤模型和HE染色、免疫组化、TUNEL等方法对体外相关研究结果进行了验证。体内外实验结果显示:DVDMS-PDT发挥抗肿瘤作用的过程中诱导产的自噬对结肠癌细胞具有保护作用;实验条件下自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)预处理HCT116细胞可抑制其发生自噬,并增强DVDMS-PDT的抗肿瘤效果。另外,研究还发现联合治疗方案抗肿瘤效果突出可能与氯喹增强DVDMS-PDT对结肠癌CD133+肿瘤干细胞的杀伤作用有关,相关结果还需进行深入的后续研究。本研究中自噬抑制剂只采用了氯喹,用法和用量未作详细探讨,为了取得更好的疗效并控制毒副作用,未来应用方面还需对其他自噬抑制剂以及相应的用法和用量进行详尽的研究。结论本课题研究表明:华卟啉钠介导的光动力疗法对结肠癌具有良好的抑制作用,相同条件下,其抗肿瘤能力显著优于阳性对照药Photofrin;DVDMS-PDT通过诱导结肠癌细胞凋亡进而发挥抗肿瘤作用,但是该过程中诱导产生的自噬为结肠癌细胞的自我保护作用;进一步的研究发现,联用自噬抑制剂氯喹可显著增强DVDMS-PDT抗肿瘤作用,这可能与杀伤结肠癌CD133+肿瘤干细胞相关。