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下腰痛是一种常见的慢性疾病,有70%-85%的人群在一生中会有下腰痛病史。在45岁以下人群中,下腰痛是丧失劳动能力的主要原因。每年治疗费用高达数十亿美元,给社会和家庭带来巨大的经济压力。椎间盘退变被认为是下腰痛的主要病因,退变的椎间盘会发生细胞生物功能的改变,包括细胞结构的丢失、细胞代谢产物的堆积、细胞外基质的退变以及促炎性分子表达的增加等。椎间盘退变的病理进程中常常伴有炎症反应的发生,有诸多炎性因子在局部表达升高,比如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-9、IL-16、PGE2以及MMPs等。以往关于椎间盘退变过程中炎症反应的作用机制的研究发现,炎症促进椎间盘退变的病理进程,引起下腰痛以及神经根放射痛等症状。目前通过控制炎症缓解椎间盘源性腰痛的治疗措施效果差强人意。脂肪因子广泛参与人体能量代谢过程,在诸多疾病的病理生理进程中发挥重要的调节作用。在最近的研究中发现,脂联素作为一种重要的脂肪因子,在炎症性疾病过程中发挥重要的调节机制。在心血管内皮细胞中,脂联素能够发挥抗炎作用,保护细胞免受炎性因子的侵害。在骨和软骨疾病的研究中,脂联素及其受体广泛参与病理生理进程。另有研究发现,脂联素与TNF-α之间存在相互抑制的作用机制。但脂联素与椎间盘组织之间的相关性研究仍未见相关的报道。因此,脂联素及其受体是否在椎间盘组织中表达,是否在维持椎间盘正常功能中发挥作用,是否与椎间盘退变等级之间存在相关性,能否在椎间盘退变时发挥抗炎作用,这些研究的开展将会对寻找全新椎间盘退变治疗靶点提供理论基础。为此我们将针对此问题展开研究,研究分如下三个部分:第一部分:人类髓核细胞的体外培养与细胞表型鉴定背景:人类髓核细胞来源于脊索细胞,以往应用软骨细胞的细胞表型对髓核细胞进行鉴定分析并不科学,应采用脊索细胞的细胞表型进行分析研究。以往术中进行髓核组织取材存在效率低、样本成分混杂、过程复杂、样本容易污染的缺点,需要寻找更好的取材方法。目的:对手术中所取组织进行体外细胞培养并进行髓核细胞表型鉴定,明确其是否为纯净的髓核细胞,验证应用手术显微镜术中取材的可行性。方法:术中在手术显微镜下小心分离髓核组织,并按照常规方法进行体外细胞培养。应用免疫组织化学染色技术对组织切片及体外培养细胞爬片进行KRT19和CDH2染色分析。结果:术中所取样本组织的组织切片以及体外培养细胞爬片的KRT19和CDH2免疫组织化学染色结果均为阳性。结论:椎间盘术中应用手术显微镜进行组织样本取材,能够获得纯净的髓核组织样本并满足实验要求。第二部分:脂联素及其受体在髓核组织和髓核细胞中的表达以及参与炎症反应作用机制的初步探讨背景:脂联素及其受体广泛表达于多种组织器官中,在人类髓核组织以及髓核细胞中是否存在表达,在正常及退变的髓核组织和髓核细胞中的表达是否存在差异,仍未见相关报道。目的:明确正常及退变的髓核组织和髓核细胞中脂联素及其受体Adipo R1、Adipo R2和T-cadherin以及炎性因子TNF-α的表达情况。方法:分别对正常及退变的髓核组织及髓核细胞中脂联素及其受体Adipo R1、Adipo R2和T-cadherin以及炎性因子TNF-α进行免疫组织化学染色、RT-PCR和Western-Blotting检测分析。结果:在正常及退变的髓核组织和髓核细胞中,脂联素及其受体Adipo R1、Adipo R2和T-cadherin均呈阳性表达;在正常髓核组织和髓核细胞中,脂联素的表达水平高于退变的髓核组织和髓核细胞,而脂联素受体Adipo R1、Adipo R2的表达水平则低于退变的髓核组织和髓核细胞。T-cadherin的表达水平在正常和退变的髓核组织和髓核细胞中无统计学差异。TNF-α在正常及退变的髓核组织和髓核细胞中均呈阳性表达,在退变的髓核组织和髓核细胞中的表达量明显高于正常髓核组织和髓核细胞。结论:在正常及退变的髓核组织和髓核细胞中,脂联素及其受体Adipo R1、Adipo R2和T-cadherin以及TNF-α在细胞、蛋白及mRNA水平均存在表达;脂联素受体Adipo R1、Adipo R2在脂联素水平降低时存在补偿性上调机制;脂联素与TNF-α的表达水平呈负相关,脂联素可能在维持椎间盘内稳态中发挥重要作用。第三部分:髓核细胞中脂联素与TNF-α的表达及脂联素抗炎作用机制研究背景:脂联素与椎间盘退变分级之间是否存在相关性?退变髓核细胞中TNF-α表达量升高,脂联素能否对体外培养的退变髓核中TNF-α表达量产生影响?这是本部分实验研究的主要内容。目的:明确脂联素与椎间盘退变分级之间的相关性;明确脂联素对体外培养退变髓核细胞中TNF-α表达的影响。方法:取髓核组织块进行体外培养,取培养基进行ELISA检测脂联素含量,并与椎间盘退变等级之间进行统计分析;对体外培养的退变髓核细胞进行浓度梯度的脂联素干预,应用ELISA检测培养基中的TNF-α含量;应用固定浓度脂联素对体外培养的退变髓核细胞进行干预,应用ELISA检测培养基中不同时间点的TNF-α含量。结果:脂联素的表达水平与椎间盘退变等级呈负相关。经脂联素干预后髓核细胞培养基中TNF-α表达量呈下降趋势,且在各时间点均低于对照组。结论:脂联素能够明显抑制髓核细胞中TNF-α的表达并发挥抗炎作用。