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L-精氨酸是一种半必需碱性氨基酸,是人体代谢中的一种重要氨基酸,在食品、医药、饲料等行业具有广泛的应用。黄色短杆菌是一类兼性厌氧、化能异养型的革兰氏阳性短杆状细菌,广泛应用于生产赖氨酸、谷氨酸和抗噬菌体。本课题以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)为出发菌,对其基因组测序结果进行了初步分析,并以其作为出发菌株,采用分子生物学的技术手段探索建立敲除体系、对精氨酸合成途径中的酶基因arg B、arg C、arg D、arg E、arg J、car AB及转运蛋白基因lys E、arginine transporter进行过量表达,研究其对精氨酸氨酸合成的影响。具体内容包括:对利用传统Sanger测序与Solexa测序相结合的方法获得的ATCC14067测序结果进行初步分析,并利用相关的软件对基因组的串联重复序列,插入序列,基因组岛及噬菌体进行了系统的分析。尝试多种方法进行敲除,主要包括Cre/loxp敲除系统及借助敲除载体pk18mobsac B。前者是通过PCR重叠延伸的方法,获得Cre/loxp敲除盒,将其直接以片段形式或借助载体转入ATCC14067。后者同样利用重叠延伸PCR方法,构建敲除载体pk18mobsac B-Δarg B。采用PCR方法扩增得到转运蛋白基因lys E、arginine transporter,以ATCC14067为出发菌株,将构建的重组质粒p EC-XK99E-csp-lys E、p EC-XK99E-csp-arg transporter转化ATCC14067得到重组菌14067-p EC-XK99E-csp-lys E、14067-p EC-XK99E-csp-arg transporter。再将重组质粒p EC-T18-arg C、p EC-T18-arg C-arg B、p EC-T18-arg C-arg JBD、p EC-T18-arg C-arg E、p EC-T18-arg E、p EC-T18-arg E-arg B、p EC-T18-arg E-arg JBD、p EC-T18-Car AB、p EC-T18-Car AB-arg B、p EC-T18-Car AB-arg E及p EC-T18-car AB-arg JBD分别转化上述两株重组菌。其中精氨酸表达量最高的菌株相对于出发菌ATCC14067提高了91%,实时荧光定量PCR检测重组菌中arg B、arg C、arg D、arg E及arg J基因在m RNA水平的表达量均是ATCC14067的2.1倍左右,基因car A、car B均是ATCC14067的2倍。在14067-T18-AB-JBD-lys E中,基因lys E在m RNA水平表达量最高,是ATCC14067的2.6倍。基因arg transporter在重组菌14067-T18-C-JBD-at中m RNA水平表达量最高,是ATCC14067的2.52倍。