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转录因子(transcriptionfactor,TF)是一类能与基因启动子上的顺式作用元件特异性结合的DNA结合蛋白,可以通过结合下游基因启动子上的顺式作用元件来调节一系列下游基因的表达,所以筛选耐盐能力优良的转录因子再通过基因工程手段培育抗逆植物新品种的过程中极其重要。为了从木本盐生植物刚毛柽柳(Tamarix hispida)中克隆并筛选获得耐盐能力优良的COL基因,本研究鉴定了 8个ThCOLs基因,分析了这些基因在各种逆境胁迫后的表达模式,并选择其中的受盐胁迫高度诱导表达基因验证其耐盐功能。具体结果如下:通过对前期建立的7个刚毛柽柳转录组序列的查找,克隆获得8个单一并具有完整开放读码框(ORFs)的ThCOLs基因(命名为ThCOL1-8)。8个ThCOLs基因编码区长度为1089-1467 bp,编码氨基酸残基个数为362-488,预测的相对分子质量大小为39.6-53.6 kDa,理论等电点(pI)为4.83-7.48。多序列比对结果显示8个ThCOLs转录因子主要分为三类,其中ThCOL2、ThCOL5和ThCOL8亲缘关系较近,属于第一类,为N端含有两个完整B-BOX结构域的转录因子;ThCOL3属于第二类,为N端含有一个完整B-BOX结构域的转录因子;ThCOL1、ThCOL4、ThCOL6和ThCOL7属于第三类,为N端含有一个完整的B-BOX结构域和一个二级结构发生改变的B-BOX结构域的转录因子。不同非生物胁迫(高盐、干旱、重金属)和ABA处理后刚毛柽柳根、叶组织中8个ThCOLs基因表达模式分析结果显示,8个ThCOLs基因在胁迫后表达量都发生了明显改变,表明这些基因都为胁迫应答基因,可能至少参与了一种刚毛柽柳的抗逆应答。其中ThCOL2基因在刚毛柽柳根和叶中盐胁迫下大部分时间点的表达都发生了显著变化,其可能在刚毛柽柳在盐胁迫应答过程中起重要作用。为了进一步验证ThCOL2基因是否参与了刚毛柽柳的抗逆应答调控,构建了重组载体pROKⅡ-ThCOL2和pFGC5941-ThCOL2,进行刚毛柽柳瞬时转化以获得瞬时过表达和抑制表达ThCOL2基因刚毛柽柳,同时以pROKⅡ瞬时侵染刚毛柽柳作为对照。对共培养不同时间点的三种瞬时表达刚毛柽柳ThCOL2基因表达分析显示成功获得瞬时过表达(OE)和抑制表达(IE)转基因株系。进一步的生理染色和生理指标结果表明,过表达ThCOL2基因在150 mMNaCl胁迫下可通过调节保护酶类的活性,增强转基因刚毛柽柳细胞内清除活性氧能力,促使O2-和H2O2的积累减少,从而减少细胞受损或细胞死亡,增强植物的耐盐性。提示ThCOL2基因可能是一个耐盐能力优良的候选基因。为了更详细地研究ThCOL2基因可能参与的耐盐调控机制,对ThCOL2基因的亚细胞定位和转录激活活性进行了研究,结果表明ThCOL2定位于细胞核且具有转录激活活性,转录激活结构域位于139-346aa(不含保守结构域的中间区域)。进一步利用TF-Centered Y1H技术(以转录因子为中心的酵母单杂交技术)分析了 ThCOL2转录因子识别的顺式作用元件。未知元件“ATTGTGAAAT”出现的次数最多。缺失和突变分析结果显示,“GTGAAA”为ThCOL2转录因子识别的核心作用元件,表明该基因可能通过与其结合,从而调控下游基因的表达。在以后的研究中,将会对ThCOL2转录因子直接调控的下游基因进行查找与鉴定,以分析ThCOL2转录因子的耐盐调控网络。