Asia Ⅰ型口蹄疫抗原单抗ELISA检测方法建立及疫苗种毒的分子鉴定

来源 :中国兽医药品监察所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gellycgy
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采用蔗糖密度梯度离心法纯化灭活AsiaⅠ型(新疆毒株)口蹄疫病毒146S抗原,免疫BALB/C小鼠,融合脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞,使用间接夹心ELISA方法筛选,获得4株可稳定分泌抗AsiaⅠ型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,其中1#G3C2、2#G6B9、10#C2G1细胞培养上清抗体效价可达1:20000以上,腹水抗体效价可达1:106以上;8#E3C10细胞培养上清抗体效价也可达1:5,120以上,腹水抗体效价可达1:81,920以上。四株单抗的亚型分别是1#G3C2、8#E3C10、10#C2G1均为IgG1亚类;2#G6B9为IgM亚类。经SDS-PAGE和免疫组化染色确定1#G3C2、2#G6B9、10#C2G1单抗针对构象型表位,而8#E3C10单抗针对线型表位。其中8#E3C10腹水单抗不纯,需要进行亚克隆,以提高纯度。四株单抗均有中和能力,其中8#E3C10单抗中和能力最弱。均具有很好的型特异性。以上述1#G3C2、2#G6B9、10#C2G1单抗的混合抗体为基础,建立了间接夹心ELISA方法。使用该方法测定了AsiaⅠ型病毒灭活抗原、O型病毒灭活抗原、正常BHK21细胞培养液,结果表明该方法特异性好,所测定OD值和AsiaⅠ型抗原稀释倍数呈明显线性关系。采用该方法对11批AsiaⅠ型、O型单价或双价成品疫苗破乳抗原进行了测定,结果表明不同批次不同企业生产的疫苗完整病毒颗粒抗原含量有差异,进一步完善有望用于成品AsiaⅠ型口蹄疫疫苗中有效颗粒抗原含量的测定,从而发展成为一种疫苗效力检验替代方法。采用RT-PCR技术,扩增测定了制苗种毒(新疆株和LC株)VP1基因序列,对生产企业制苗种毒进行了“身份”鉴定,结果表明各企业均以规程批准的制苗毒株生产疫苗。同时与我国目前AsiaⅠ型主要流行毒株(江苏株)VP1核苷酸序列及推导氨基酸序列进行了比较,结果表明,新疆株对江苏株的核苷酸同源性为84.4%,氨基酸同源性为89.6%;LC株与江苏株的核苷酸同源性为84.4%,氨基酸同源性为90.0%;新疆株与LC株的核苷酸同源性为83.4%,氨基酸同源性为87.2%。通过对两个疫苗毒株的VP1基因及推导氨基酸序列的分析,发现两个疫苗株与流行株(江苏株)不属于同一基因型(VP1核苷酸序列同源性>85%为同一基因型),新疆株和LC株的VP1G-H环140~160位氨基酸和羧基端203~211位氨基酸残基内的分别有9个、7个变异位点,但两者的RGD基序均未发生改变,其利用整联蛋白途径来识别宿主细胞位点能力也未发生变化。因此使用这两个疫苗种毒株制备出的疫苗能否完全保护当前主要流行毒株(江苏株),还有待进一步的研究。
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