氧化应激被认为是我国集约饲养条件下猪繁殖性能下降的重要因素。随着我国养猪业集约化程度的提高,养殖环境与猪生物学特性的背离增加,从而造成环境应激的增加,养猪生产中的多种环境应激往往造成机体与组织氧化自由基的升高,氧化应激是多种应激因素损害繁殖性能的共同机制。另一方面,动物的繁殖活动伴随氧化应激水平的提高,氧化应激被认为是动物繁殖的代价。在雌性动物的繁殖过程中,卵巢是最重要的器官之一,卵巢的质量将决定动物的繁殖能力和生产性能,卵巢在发育过程中,绝大多数卵泡发生了退化和消失,该过程称为卵泡闭锁,最近的研究表明卵泡闭锁的主要原因是颗粒细胞凋亡。Puma是Bcl-2家族BH3-only亚家族一新成员,可以被快速诱导并有强大的促凋亡作用,是P53依赖和非依赖凋亡途径的关键介导者。它与卵泡闭锁、肿瘤发生和组织损伤等密切相关,是一个非常重要的调节卵泡闭锁、肿瘤发生和组织损伤的靶点。Puma受到多种转录因子的调控,如P53、P73、NF-κB、FoxO家族和c-Myc等。实验室的前期研究表明,小鼠卵巢颗粒细胞添加200μμM H2O2后,FoxO1可以介导Puma的表达来诱导颗粒细胞凋亡,但对氧化应激上调小鼠卵巢颗粒细胞Puma表达的机制没有进行深入研究。大量研究证实P53和NF-κB是调控Puma表达最为重要的两个转录因子,本研究选用上述两种转录因子抑制剂探讨P53和NF-κB是否也参与了氧化应激对小鼠卵巢卵泡颗粒细胞Puma表达的调控。本试验选用15μM PFT-α和20μM PDTC分别抑制P53和NF-κB活性,检测了它们对氧化应激诱导的Puma基因mRNA表达的影响;通过免疫荧光染色和染色质免疫共沉淀,检测2001μM H202处理对颗粒细胞P53出入核以及P53与Puma启动子结合的作用,探索PFT-α和H202的联合处理是否可以抑制氧化应激诱导的P53入核以及与Puma启动子的结合;TUNEL检测来研究PFT-α对氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡的影响,同时对凋亡相关基因进行荧光定量PCR检测;最后利用免疫荧光染色,检测JNK的抑制剂(SP600125)对氧化应激诱导P53入核的影响,以及利用TUNEL也检测SP600125处理对氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡的影响。qRT-PCR结果表明,PFT-α可以抑制氧化应激诱导的Puma基因mRNA表达的上调,PDTC则不能抑制Puma基因mRNA表达的上调;免疫荧光染色和染色质免疫共沉淀结果显示,200μM H2O2处理后可以促进P53的入核以及与Puma启动子的结合,而PFT-α和H2O2的联合处理可以抑制P53的入核以及与Puma启动子结合;TUNEL检测表明PFT-α可以抑制氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡,同时PFT-α可以降低氧化应激诱导Bim和Caspase-3基因mRNA的表达,但差异不显著;最后免疫荧光染色显示SP600125可以抑制氧化应激诱导的P53入核,同时SP600125处理也可以抑制氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡。本试验阐明了氧化应激上调小鼠卵巢颗粒细胞Puma表达的机制,即氧化应激处理可以激活颗粒细胞JNK的活性,激活的JNK使P53磷酸化并且入核;入核后的P53与Puma启动子结合增加,引起Puma基因mRNA表达增加,从而诱导颗粒细胞的凋亡。揭示小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的分子机制对可以为人们发展新的技术与措施改善母猪动物繁殖力提供借鉴,也可以为人类生殖疾病的防治以及延长女性生育期等提供有价值的借鉴。