目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我国HCC发生的主要病因。乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus Xprotein，HBx）由HBV基因组中最小的开放读码框编码，作为一个多功能调节蛋白，HBx在HBV感染相关肝癌的发生发展过程中起重要作用。研究表明，HBx可以直接活化多种原癌基因或抑制抑癌基因（如c-myc、c-jun、p21、p53等）的转录，也可以激活多种信号通路（如Wnt、PI3K、JNKs、MAPK/ERK等），从而影响细胞增殖和分化等多种生物学行为，参与肝细胞的恶性转化进程，但是其具体的分子机制不明。Wnt信号通路是真核生物进化过程中一条高度保守的信号通路，是调控胚胎早期发育的重要信号分子，对维持成体干细胞的自我稳定性也发挥了重要作用。Wnt信号通路的异常活化与人类多种肿瘤的发生密切相关，而其异常活化至少与50%以上的HCC发生相关。除了CTNNB1（β-catenin）、APC、AXIN1以及AXIN2基因突变直接激活Wnt信号通路外，其他相关调控因子的异常，也参与其异常活化。分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是Wnt信号的主要胞外抑制因子，其通过竞争性抑制Wnt配体与Frizzled受体结合，阻断Wnt信号通路的活化。研究证实，多种肿瘤的发生与SFRPs基因的表达下调相关，而SFRPs基因的表达下调与其启动子区高甲基化修饰密切相关。目前，在许多实体肿瘤如肝癌、肺非小细胞癌、胃癌、结肠癌等中均发现了SFRPs基因启动子区高甲基化修饰。近年来研究表明，病毒感染机体后，其编码蛋白能够以表观遗传修饰的方式直接调控宿主重要基因的转录，影响细胞增殖、分化以及侵袭等多种细胞生物学行为，与疾病的发生发展密切相关，如HCV核心蛋白以及NS5A蛋白等。但是，HBx能否以表观遗传修饰方式调控SFRPs的表达从而参与HBV相关疾病的发生，目前还无相关报道。课题组前期实验证实：在多种肝癌细胞中，HBx能够明显下调SFRP1和SFRP5的表达，甲基化抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，DAC）处理细胞后，SFRPs的表达能够得到部分回复。本研究拟深入分析HBx表观调控SFRPs的具体分子机制，并在体内实验中观察HBx表观调控SFRPs后对荷瘤鼠的增殖及侵袭力的影响，从而探讨HBV感染后病毒编码蛋白HBx异常活化Wnt信号通路，并参与肝细胞癌发生的分子机制。方法：1）通过免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）、染色质免疫共沉淀实验（chromatin immunoprecipitation，ChIP）观察HBx调控SFRP1、SFRP5基因启动子区甲基化转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）、组蛋白去乙酰化修饰酶（histone deacetylases，HDACs）的结合变化；用DAC和/或曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）处理细胞后，检测上述表观修饰蛋白在SFRP1、SFRP5基因启动子区的结合变化，深入研究HBx表观调控SFRP1、SFRP5基因转录的分子机制；2）在HBV感染的肝癌组织标本中，采用Real-time PCR及多因素关联分析，探讨SFRP1、SFRP5的表达水平或启动子区甲基化修饰状态与DNMT1表达的相关性；3）在稳定表达HBx的肝癌细胞系中，通过Western blot和免疫荧光实验，观察沉默DNMT1或过表达SFRP1、SFRP5后，对Wnt信号通路活化以及上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）发生关键分子表达的影响；4）在荷瘤小鼠模型中进一步验证沉默DNTM1或过表达SFRPs后，肝癌细胞增殖、侵袭能力的改变，并探讨其可能的分子机制。结果：通过IP实验证实：HBx可以与DNMT1、DNMT3A以及HDAC1直接结合。ChIP实验表明，HBx能够诱导DNMT1、DNMT3A以及甲基化结合蛋白（methyl-CpG binding domain protein，MBD）富集于SFRP1、SFRP5基因启动子区，而组蛋白H3（acetylated histone H3，AcH3）的乙酰化修饰水平以及乙酰化转移酶P300在其启动子区结合明显降低。单独用DAC或TSA处理细胞，能够抑制DNMT1、MBD1、MBD2与SFRP1、SFRP5启动子区的结合，同时组蛋白H3乙酰化水平及P300的结合得到有效回复，DAC与TSA联合处理后，上述效应明显增强。乙型肝炎病毒相关肝癌组织标本中SFRP1和SFRP5表达明显下降，并与DNA甲基化转移酶DNMT1的表达呈负相关。SFRP1、SFRP5启动子区甲基化修饰水平与DNMT1的表达呈正相关。多因素关联分析表明，肝癌组织中SFRP1和SFRP5表达水平与肝癌组织的分化程度呈正相关，提示SFRPs的表达下调参与肝癌恶性转化的早期过程。Western blot和免疫荧光实验证实，沉默DNMT1或过表达SFRP1、SFRP5能够抑制Wnt信号重要分子β-catenin以及相关靶基因c-myc、cyclinD1的表达，并可以逆转HBx诱导的EMT进程。荷瘤鼠皮下成瘤实验发现，沉默DNMT1或者过表达SFRP1、SFRP5，能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长速度及肿瘤大小，并且可以下调Wnt信号效应分子β-catenin、增殖相关抗原PCNA以及侵袭相关分子VEGF、MMP9的表达。结论：HBx通过诱导DNMT1、DNMT3A以及HDAC1富集于SFRP1、SFRP5基因启动子区，使其启动子高甲基化修饰，从而沉默SFRP1和SFRP5的表达。体内外实验证实HBx通过下调SFRP1和SFRP5的表达，诱导Wnt信号通路异常活化，并加速EMT的进程，促进细胞增殖与侵袭，参与了肝细胞癌的发生。本研究为阐明HBV感染相关HCC的发病机制提供了新的理论依据，同时为研发新的针对Wnt信号通路相关拮抗因子的分子抑制剂奠定了基础。