论文部分内容阅读
受精后,胚胎发生了自母源基因组向合子基因组的转变,即合子基因组激活(Zygotic genome activation,ZGA)。在此期间发生了包括H3K27me3在内的表观遗传修饰重塑过程。UTX(Ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene on the X chromosome)作为H3K27me3特异性去甲基化酶,在调控植入后胚胎发育、细胞重编程和细胞分化方面起重要作用。UTX是否调控植入前胚胎发育,特别是ZGA过程,到目前为止还未见报道。为了探究UTX在植入前胚胎发育中的影响,我们设计了3部分试验:首先,构建了双功能的pcs2-UTX过表达载体,并对其功能进行了体内外验证;同时又制备了Utx转基因小鼠(Utx+小鼠)模型,繁育至F3代。其次,利用Utx+小鼠胚胎(体内模型)和注射Utx-mRNA的胚胎(体外模型),探索过表达Utx基因对胚胎发育的影响。最后,通过Utx干扰试验和胚胎发育挽救试验,找到了UTX在小鼠合子基因组激活过程中的靶向基因Zscan4d。主要结果如下:(1)将pcs2-UTX表达载体转染到小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEF),IF和WB技术检测底物蛋白H3K27me3表达的结果显示,H3K27me3修饰显著降低。利用pcs2-UTX载体经体外转录获得了Utx-mRNA,注射于受精卵胞质,IF检测结果显示,底物蛋白H3K27me3的荧光强度显著减弱。利用原核注射制备了Utx转基因小鼠(Utx+小鼠),F0代阳性率为28.6%,经连续配种繁殖,繁育至F3代。(2)为了解UTX对小鼠生殖能力的影响,我们对Utx+小鼠进行了相关的鉴定。转基因小鼠的产仔率和排卵率均显著低于同窝野生型小鼠,并发现转基因小鼠的卵巢体积和质量均小于同龄同窝野生小鼠。同样,我们发现转基因小鼠胚胎发育率显著低于同窝野生型小鼠。利用qPCR技术对转基因小鼠的胚胎进行了12个ZGA相关基因(MuERVL、Zscan4d、Tcstv1、Tcstv3、Cdc2、eIF-1a、Rif1、Rpl23、U2afbp-rs、Ube2a、Mt1a、Wee1)和4个母源效应基因(Lin28a、Stella、Gdf9、Brg1)的检测。其中Zscan4d、Tcstv3和Gdf9的表达显著上调。我们又通过模拟体内试验(Utx+小鼠),对直接注射Utx-mRNA的胚胎进行了研究,发现MuERVL、Zscan4d、Tcstv1、Tcstv3和Lin28a的表达显著上调。此外,IF结果也显示,ZSCAN4D蛋白的荧光强度显著增强。综合上述两项结果发现,UTX主要靶向于Zscan4d基因。(3)为了进一步验证Utx基因在胚胎发育中的作用,设计并合成特异干扰UTX的siRNA,通过qPCR、IF和WB检测发现干扰效率为90%,并且发现干扰后的胚胎发育率均显著降低。我们对干扰Utx后的胚胎检测了12个ZGA和4个母源效应基因的表达情况。结果显示,Zscan4d、Tcstv1和Stella的表达显著降低。IF结果表明,ZSCAN4D蛋白的表达显著降低。以上结果再次验证了UTX靶向于Zscan4d基因的结论。(4)综合转基因小鼠、直接注射mRNA以及siRNA的结果,我们发现UTX影响Zscan4d的表达。ChIP-qPCR也显示,UTX直接结合Zscan4d基因的启动子区域。已有研究表明,Zscan4d是着床前胚胎端粒延伸的关键基因之一。为了进一步验证上述结果,我们构建了Zscan4d的体外转录载体pcs2-ZSCAN4D,并进一步的设计了“挽救(rescue)”试验。同时向受精卵中注射Utx的siRNA和Zscan4d的mRNA,可以部分缓解由干扰UTX后导致的胚胎发育异常的现象。没有完全“挽救”的原因可能Zscan4d是UTX的靶基因之一,即UTX调控的基因不仅仅是Zscan4d。本研究通过UTX转基因小鼠模型、mRNA过表达以及siRNA干扰等试验,主要揭示了组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX在植入前胚胎发育中的重要作用。我们发现异常的UTX表达会导致ZGA时间紊乱;UTX可以直接结合并激活ZGA事件中的关键基因Zscan4d而有利于植入前胚胎发育。