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DNA甲基化作为一种表观遗传标记,调节基因转录,异常的DNA甲基化与肿瘤发生相关。哺乳动物早期胚胎发育、配子发生、体细胞重编程等过程中,DNA甲基化均呈现出动态的变化,即DNA甲基化存在擦除和重建。哺乳早期胚胎发育存在两次明显的DNA去甲基化过程。最早的一次主动DNA去甲基化发生在受精后的原核期胚胎中,即卵母细胞胞质中的去甲基化因子对父源基因组进行的快速、广泛的去甲基化。这一过程对于父源基因组的激活及早期胚胎发育的顺利进行具有重要意义。另一个时期发生在原始生殖细胞的形成和迁移过程中。研究表明,哺乳动物中主动DNA去甲基化涉及到多条调节途径,其中包括：其中包括DNA甲基化转移酶介导的DNA去甲基化,TET(ten-eleven translocation)家族的三种蛋白(TET1,TET2,TET3)成员参与其中催化5mC的羟基化作用；与DNA修复通路关联的主动去甲基化途径,激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)即参与其中；以及其他蛋白,如延伸复合体3蛋白(elongator complex3,ELP3)等介导以及由其他因子所介导的去甲基化途径。本实验利用实时荧光定量PCR和免疫荧光染色的方法,检测了小鼠卵母细胞成熟及受精过程中,参与主动去甲基化的Aid、Elp3、Tet3三种基因的mRNA和蛋白水平的变化,研究其在植入前胚胎主动去甲基化中的表达及相互作用。主要研究结果如下：1.Aid基因的mRNA在GV期卵母细胞中开始表达,MII期卵母细胞中进一步积累,受精后开始消耗,待合子基因组激活后重新开始合成。而在孤雌激活胚胎中,Aid基因的转录在2细胞期不被重新启动,说明父源基因组的存在与激活对Aid基因的表达有重要作用。免疫荧光染色发现在卵母细胞、合子和2-细胞胚胎中均能检测到AID蛋白在胞质中的信号,没有明显的核质定位。并且AID的荧光强度在PN4期有所增强,到2细胞又下降。在孤雌激活得到的2细胞胚胎中几乎检测不到荧光信号。结合AID在卵母细胞中的表达及卵母细胞自身特点,即卵母细胞在成熟过程中要积累大量的mRNA和蛋白,故推测MII期Aid基因的大量表达AID可能作用于随后发生的受精过程。2.Elp3基因的mRNA在卵母细胞中开始积累,受精后原核期mRNA表达量显著升高,合子基因组激活后表达量出现降低。免疫荧光染色显示,在GV和MII期卵母细胞及PN2、PN4和2细胞胚胎中,均检测到ELP3蛋白的荧光信号,并且荧光信号在胞质和原核中均有分布,提示ELP3可能参与雄原核的主动去甲基化；在MII期卵母细胞中,ELP3荧光信号还出现了与纺锤体共定位的现象,提示其有可能作为一种微管结合蛋白,对减数分裂进程中纺锤体结构的动态改变及功能执行起到调节作用。3.Tet3基因的mRNA在卵母细胞中开始转录,受精后PN2期mRNA表达量显著升高,进入2细胞后表达量显著降低。推测Tet3基因可能参与雄原核的主动去甲基化过程中。检测TET3蛋白的荧光信号,发现其在胞质中弥散状分布。在MII期开始到2细胞期胚胎中均表现出与纺锤体的共定位现象。推测TET3除了具有主动去甲基化作用外,可能在特定时期通过调控一些分裂相关因子参与减数分裂调控,或者是否能够作为一种微管结合蛋白参与减数分裂进程中纺锤体结构的动态变化及功能调节。4.对早期胚胎发育各时期中Aid、Elp3和Tet3三基因的表达进行对比,发现在卵母细胞中三种基因都有一定量的mRNA储备,并且Aid和Elp3基因的表达水平显著低于Tet3基因。受精后进入原核阶段,Aid基因即不发生转录,而Tet3基因的表达量仍显著高于Elp3基因。故推测在受精后雄原核主动去甲基化过程中,Tet3基因可能是作为主要作用因子参与,而Aid和Elp3基因可能更多的是作为辅助因子参与。纵向分析三种基因在各个时期中的表达变化,发现Aid除了在卵母细胞和2细胞中检测到表达外,其他时期都没有检测到。推测其在雄原核的主动去甲基化过程中的作用可能不是很强。2细胞后的各个时期中,Elp3和Tet3基因的表达水平均出现显著降低,直至囊胚阶段都处于较低水平。推测随着雄原核主动去甲基化的完成,卵裂期母源基因组的去甲基化过程中所研究的三种基因不起主要作用,即可能更多的是发挥其除了去甲基化之外的其他作用。