论文部分内容阅读
研究背景:端粒是真核生物染色体3′末端由富含G的DNA重复序列和端粒结合蛋白（telomere binding proteins,TBPS）组成的核蛋白复合物,就像鞋带末端的金属结一样,其功能主要是维护染色体稳定,防止染色体发生丢失、重排、末端融合和被酶消化降解等。正常细胞复制时,由于DNA聚合酶不能完整复制线型的DNA末端,端粒在每次细胞分裂后将缩短50-100bp,当缩短到一定程度时,DNA变得不再稳定,双螺旋解开,细胞停止分裂,开始衰老或死亡,这就是正常细胞自身遗传程序决定的衰老和死亡的原因。而大多数恶性肿瘤细胞因为激活端粒酶（telomerase）,能把端粒缩短的部分补上,细胞分裂后端粒并不缩短,这是肿瘤细胞永生化的重要前提条件,也使得端粒酶成为识别肿瘤细胞和正常细胞的重要标志之一。研究表明,90%以上的恶性肿瘤细胞都激活端粒酶,因此端粒酶成为肿瘤诊断和抗肿瘤药物设计的新靶点,以端粒酶作为抗肿瘤药物作用的靶标,建立肿瘤抑制剂筛选模型,在分子水平上筛选针对端粒酶的抑制剂,已成为寻找广谱抗肿瘤药物新途径。人的端粒酶由三个组分构成,端粒酶RNA（Telomerase RNA Component,TR）、端粒酶逆转录酶（Telomerase ReverseTransciptase,TERT）和端粒酶相关蛋白1（Telomerase associated protein,TEP1）,端粒酶有活性的最小组成单位hTERT和hTR,重组端粒酶活性需要这两部分的正确组装。而hTERT和hTR的结合,就像酶和底物的结合,在细胞周期S期结合,表现出端粒酶活性,其它期又分开,这说明hTR-hTERT结合是可逆的,容易受抑制剂的影响。因此,如果筛选模型是针对hTR-hTERT的结合,就能大大提高筛选的特异性。由于hTR是RNA,降解快,体外难以操作,研究RNA-蛋白质相互作用的传统方法在一般的实验室不易于进行,而senGupta等的酵母RNA三杂交系统则巧妙地采取在细胞内合成RNA及研究RNA分子的策略,简单易行,而且提供了一个真核细胞体内环境,是用于研究蛋白质和RNA相互作用绝佳载体,在酵母三杂交系统中,其它的相互作用都是已知的,唯一可变的是我们需要研究的未知的蛋白质和RNA之间的相互作用,只要他们之间存在相互作用,就可用激活报告基因的转录,通过报告基因的表型特征来筛选阳性克隆。反过来,如果研究的RNA与蛋白的结合是已知的,如hTR-hTERT的结合,则该系统就可以用来研究导致hTR-hTERT解离的因素,或者作为筛选抑制hTR-hTERT结合的药物筛选模型,即当存在抑制两者结合的因素时（与hTR竞争结合hTERT的抑制剂）,报告基因不表达。并且该系统可以配合高自动化点样技术,建立高通量的药物筛选模型。本课题组根据酵母RNA三杂交原理,首先找到hTR和hTERT之间相互作用的片段,然后利用这些特异的相互作用片段构建高通量特异性抑制hTR-hTERT结合的端粒酶抑制剂药物筛选模型的酵母,用于特异端粒酶抑制剂的筛选。目的:1.分别构建能够表达不同hTR和hTERT片段的诱饵和猎物质粒。2.利用酵母三杂交原理,将构建好的质粒共转化酵母,在酵母中研究hTR和hTERT结合的片段。3.将存在相互作用的hTR和hTERT质粒共转染酵母,利用构建好的酵母配合高通量点样技术建立高通量酵母三杂交系统（Y3H）。方法和内容:1.酵母表型检测及自激活性检测,使用缺陷混合氨基酸[色氨酸（Trp）,尿嘧啶（Leu）,组氨酸（His）]检测酵母菌株YBZ,L40 ura3营养需求。2.不同诱饵载体的构建与转化:采用RT-PCR的方法从肿瘤细胞中扩增人端粒酶RNA（hTR）基因后,定点突变三个位点。分别扩增定点突变后的hTR基因假结合体区,CR4-CR5及H/ACA,CR7区hTR基因片段,纯化分离定向克隆到pRH3诱饵质粒,构建包含不同hTR目的基因片段的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定后,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性自激活检验。3.不同猎物表达载体的构建及转化:采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中分别钓取含RID1、RID2、RT、C末端等区hTERT cDNA的片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3猎物质粒,构建包含不同hTERT目的基因片段的重组质粒,转化DH5α型大肠杆菌,筛选阳性克隆初步鉴定后,扩大培养,抽提质粒双酶切鉴定后进行DNA测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性自激活检验。4.将不同的诱饵和猎物质粒按排列组合共转染酵母,用缺陷生长法对hTERT和hTR在酵母中的相互作用进行确认,将初步获得的存在相互作用诱饵和猎物阳性质粒重新转化酵母,通过缺陷生长实验,β-半乳糖苷酶活性检测,酵母菌落PCR等实验进一步验证。5.利用自动化点样技术,将构建好的重组酵母三杂交酵母菌L40 ura3（转染了hTERT的RID1和hTR的假结合区的L40ura3R1、转染了hTERT的RID2和hTR的CR4-CR5区的L40ura3R2、转染了hTERT的RID1和RID2和hTR的假结合区和CR4-CR5区的L40ura3R3）用于高通量筛选特异的端粒酶抑制剂,建立Y3H系统。结果:1.结果显示:酵母菌株YBZ,L40 ura3基因表型稳定,在全培养基（YPD,YC）中生长良好,但不能在单缺陷性培养基（-Leu,-Trp,-His）中生长。将YBZ,L40ura3酵母菌株单菌落划线于含0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mM不同3-AT浓度的SD/-His琼脂平板上,30℃培养3天后,在YPD培养基上,YBZ不能生长,L40 ura3酵母菌株有少量菌落生长。提示YBZ无His基因渗漏表达,而用L40 ura3酵母菌株筛选时需要加3-AT。2.不同的重组质粒pRH3—hTR经AatⅡ,AvrⅡ双酶切鉴定与预测结果相符。测序结果证实,含不同hTR基因片段诱饵重组质粒pRH3—hTR构建成功,转化酵母后无毒性和自激活性。3.重组质粒pYESTrp3—hTERT经EcoRⅠ,HindⅢ双酶切鉴定与预测结果相符。测序结果表明pYESTrp3-hTERT猎物融合蛋白表达载体的基因序列同源性99%以上,读码框正确。转化酵母后无毒性和自激活性。4.将不同的诱饵和猎物质粒按排列组合共转染酵母,和预测的结果一样,hTERT的RID1区和RID2区分别于hTR的假结合体区,CR4-CR5存在相互作用。5.设立对照,利用3个重组酵母菌建立高通量筛选系统可用于特异的端粒酶抑制剂。结论:1.利用RNA三杂交理论,首次将人端粒酶的二个核心成分hTERT与hTR是否结合作为唯一的变量构建了端粒酶特异抑制剂高通量筛选模型。2.为阐明hTERT与hTR的结合方式提供了更简单、更精确的技术方法,并利用此方法找到hTR与hTERT在酵母中相互作用的片断。3.构建好的重组酵母三杂交酵母菌L40 ura3可用于高通量特异端粒酶抑制剂的初步筛选。