乳房炎可诱导奶牛乳腺组织、外周血液和牛奶中S 100A12成倍表达,提示在乳房炎的发生和防御过程中S100A12发挥重要的作用。在前期研究中成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库及反向Northern斑点杂交差异筛选获得S100A12基因片段的基础上,本研究对奶牛外周血液中S100A12基因进行了分子克隆与序列分析,构建了原核表达载体pCold TF-S100A12,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并检测了重组蛋白对牛源乳房炎主要致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌效果。1.利用RT-PCR从奶牛外周血液中克隆S100A12基因,将其连接到pMDTM 19-T Simple载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,结果表明重组克隆质粒pMD19-T-S100A12构建成功。生物信息学分析得知,扩增片段大小为291bp,含有一个279bp的完整开放阅读框(ORF),编码92个氨基酸的成熟多肽,并且含有S100A12蛋白的特征性分子结构即在特定位置上有1个EF-手型结构;另外,还预测到三个蛋白激酶C磷酸化位点,分别位于19-21,44-46和70-73氨基酸残基。与已报道的牛S100A12 cDNA序列(登录号：NM 174651)进行比较,核苷酸序列相似性为100%,序列覆盖编码区全长。进化树分析结果显示,奶牛S100A12基因与人、猪、猿猴S100A12基因亲缘关系比较近。2.应用RT-PCR检测发现S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系统(卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道)上皮组织中均有表达。3.BamHI和Hind III双酶切克隆质粒pMD19-T-S100A12,酶切产物与原核表达载体pCold TF连接,经质粒PCR、双酶切和测序鉴定结果表明重组原核表达质粒PCold TF-S100A12构建成功。将重组质粒pCold TF-S100A12转入高效表达菌株BL21(DE3),诱导培养后,重组菌株特异性表达大小为62kDa的蛋白条带,通过诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间的优化确定了最佳诱导条件(37℃,1.0 mmol/L IPTG,诱导表达4h). SDS-PAGE和Western blotting分析显示克隆的S100A12基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的46.7%。4.Ni-TED亲和层析法将表达的蛋白进行纯化,用Bradford法检测得知表达的蛋白浓度为0.5mg·mL-1。用纸片扩散法测定纯化的重组蛋白对大肠杆菌有抗菌效果,而对金黄色葡萄球菌没有抗菌作用。本试验结果为进一步研究奶牛S100A12基因的表达特性、基因功能和抗体的制备及筛选乳房炎早期诊断指标奠定了基础,同时为重组多肽治疗和预防奶牛乳房炎以及抗乳房炎奶牛的育种提供了相应资料。