论文部分内容阅读
第一部分gC1qR基因致宫颈癌细胞生物学性能的改变目的:球状C1q受体(globular C1q receptor,gC1qR)是一种高度酸性的受体蛋白。可介导多种生物学反应,本部分探讨gC1qR在宫颈癌中的表达情况及其对宫颈癌生物学性能的影响。方法:应用Real-time PCR、Western blot分别测定gC1qR基因在宫颈癌组织、癌旁组织以及宫颈癌细胞株C33a、SiHa、正常宫颈上皮细胞株CRL2614 中 mRNA 及蛋白质的表达情况;采用 WST-1 法(Water-soluble four azole nitrogen-1,水溶性四氮唑-1)、Transwell试验、流式细胞技术,分别对宫颈癌细胞的存活率,迁移能力以及细胞凋亡的情况进行评估。结果:gC1qR的表达在宫颈癌组织中显著低于其配对的宫颈癌旁组织;与此一致,gC1qR在宫颈癌细胞系C33a和SiHa的表达显著低于其配对的正常宫颈上皮细胞株CRL2614。此外,过表达gC1qR基因能显著降低宫颈癌细胞的存活率及迁移率,增加其细胞凋亡率。结论:gC1qR基因与抑制宫颈癌细胞存活与迁移的能力,诱导宫颈癌细胞凋亡有着一定的关系,可为宫颈癌的防治提供新线索和潜在的干预靶标。第二部分gC1qR基因致宫颈癌细胞凋亡作用机制的研究目的:观察gC1qR基因诱导宫颈癌细胞线粒体损伤及上调促凋亡蛋白p53表达的作用,探讨gC1qR基因,线粒体功能损伤,p53蛋白与宫颈癌细胞凋亡之间的相互关系。初步阐明gC1qR致宫颈癌细胞凋亡的可能分子机制。方法:以体外培养的宫颈癌细胞C33a和SiHa细胞为实验对象,构建gC1qR过表达载体,Empty vector为阴性对照,采用DCFH-DA法(组织活性氧荧光定量)、Fluo-4 AM法(钙离子荧光探针)、JC-1法(线粒体膜电位荧光探针)分别检测细胞内ROS含量、Ca2+、线粒体膜电位水平的变化来评估线粒体功能状态;且应用Western blot法来检测宫颈癌细胞内过表达gC1qR对p53蛋白表达水平的影响。在已构建了 gC1qR过表达载体、空载体组细胞株的基础上,且于72h分别共转染(1)空载体 pCB6(Negtive p53)、pCB6+p53wt(wild-type p53)和 pCB6+ p53mt(mutant-type p53);(2)p53 siRNA、Negative siRNA 后,分别采用 WST-1、Transwell试验、流式细胞技术以及DCFH-DA法、Fluo-4 AM法、JC-1法评估各分组宫颈癌细胞内线粒体功能及宫颈癌细胞生物学行为的变化。结果:初步发现过表达gC1qR基因能使宫颈癌细胞内ROS浓度、Ca2+、p53蛋白表达水平明显增加,线粒体膜电位△ψm水平显著下降,且具有时间依赖性。此外,不同质粒转染宫颈癌细胞时,我们发现gC1qR+p53wt组胞内ROS、Ca2+水平显著升高,线粒体膜电位△ψm明显降低,与此同时,宫颈癌细胞的存活率和迁移率显著降低,宫颈癌细胞凋亡率增加。而gC1qR+p53mt组或利用p53 siRNA沉默p53基因的表达可消除过表达gC1qR诱导的线粒体功能以及宫颈癌细胞生物学行为的改变。结论:gC1qR基因可诱导宫颈癌细胞线粒体损伤,且可通过p53依赖的线粒体损伤途径来诱导宫颈癌细胞的凋亡。