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本论文探讨了茶多酚与蛋白酶之间的络合机理研究,以蛋白质及活性的回收率为指标,研究络合的最适条件,包括温度、pH值、浓度、有机溶剂。并进一步研究茶多酚-蛋白酶的络合、沉淀及回收,用回收后的络合物来研究络合物的特性的变化(如最适温度、pH值、Km值、热稳定性等)以及二级结构的变化,通过圆二色谱试验手段来获得二级结构的变化与活性之间的相关信息。获得以下的初步实验结果:
1.在595nm的波长条件下的吸光度为指标,研究多酚物质与蛋白质的络合起混现象,多酚主要选取单宁酸,蛋白质则选取明胶,实验发现温度、体系的pH值、有机溶剂乙醇、反应中的多酚-蛋白质的质量比都对多酚-蛋白质络合物的生成量有一定的影响,在40℃、pH3.5、乙醇浓度为6%、明胶和单宁酸的质量比为5:1,产生的络合物的量最大。
2.茶多酚和蛋白质有络合起混现象,在特定的蛋白质浓度下,从中国绿茶中提取茶多酚与各种蛋白质络合时的起混浓度分别为:猪胰蛋白酶为0.5%;大豆蛋白酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶为0.1%;菠萝蛋白酶为0.3%;细胞色素C为0.4%。
3.以茶多酚作为原料,对菠萝蛋白酶、大豆分离蛋白、酪蛋白、细胞色素C等蛋白质进行络合、沉淀及回收,用Bradford法测定溶液中的蛋白质的含量,结果表明用0.7%的茶多酚对菠萝蛋白酶的蛋白质最大回收率为60%;0.5%的茶多酚对酪蛋白的最大回收率为7%左右;0.8%的茶多酚对大豆分离蛋白、细胞色素C的最大回收率约20%左右。
4.研究与茶多酚络合后木瓜蛋白酶的回收率、热稳定性和二级结构的变化。结果表明:在35℃条件下,茶多酚地浓度为0.7%时,木瓜蛋白酶蛋白质的回收率和木瓜蛋白酶的活性分别为79%和64%,以酪蛋白作为底物,对自由木瓜蛋白酶和TP-木瓜蛋白酶的研究性质进行研究,络合后木瓜蛋白酶的最适反应改变为从65℃~70℃,而最适反应pH值保持不变。与自由木瓜蛋白酶比较,TP-木瓜蛋白酶的热稳定性得到提高,这种提高与提高巯基含量是一致的。和茶多酚络合后木瓜蛋白酶的米氏常数发现没有变化,这些结果表明,茶多酚可以保护木瓜蛋白酶的活性。络合后部分α-螺旋转变为β-折叠,α-螺旋仅仅从23.4%减少到17%,β-折叠从41%增加到45.2%,β-转角从10.4%变化到11.1%,无规转曲从25.2%变化到26.8%。
5.茶多酚对胃蛋白酶特性的影响,以及胃蛋白酶与茶多酚络合后进行沉淀回收。结果表明胃蛋白酶对茶多酚无抑制作用,沉淀回收率较低只有10.4%,络合后的胃蛋白酶的最适反应温度以及最适pH值变化稍微变窄,而且二级结构的含量变化明显,在茶多酚与胃蛋白酶络合后,α-螺旋和无规转曲含量减少,β-折叠和β-转角含量增多。α-螺旋从28.1%较少到17.8%,β-转角从0增加到16.5%,无规转曲从37.9%减少到21.3%,β-折叠含量变化有所增加,从34.0%变化到44.4%。
6.从猪胰腺提取的α-淀粉酶与茶多酚络合后沉淀的回收及特性的影响。结果表明,络合后的α-淀粉酶的最适温度有所提高,最适pH值没有什么变化,而络合后的α-淀粉酶的耐热性有了一定的提高,络合后的Km值变小,α-淀粉酶的二级结构的四种类型的含量发生很大的变化,使β-折叠的含量从15.7%减少到0.0%,转变使α-螺旋、β-转角和无规转曲的含量都得到增加。α-螺旋含量变化较小从24.2%变化到28.2%,β-转角从26.0%增加到32.0%,无规转曲含量从34.2%增加到39.8%。