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急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上常见的急腹症之一,特别是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)并发症多,预后凶险,病死率可高达30%～40%。SAP时肾功能障碍大约为14%～43%,发展至急性肾功能衰竭(ARF)后死亡率可高达71%～84%,为临床SAP病人死亡的重要原因之一。Toll样受体4 (Toll-like receptor 4,TLR4)是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,可以特异性的识别病原微生物,偶联信号转导途径,并激活天然免疫细胞,最终导致一系列的免疫炎症反应。TLR4广泛分布于动物和人体的肝、肺、心、肾及胰腺等组织中。TLR4是介导细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)信号跨膜转导的主要受体,对于革兰氏阴性菌的感染性炎症至关重要。我们通过观察AP大鼠肾脏TLR4的表达变化,了解TLR4对急性胰腺炎相关性肾脏损伤中的影响,并提供一种新的治疗思路。目的:观察TLR4在急性胰腺炎小鼠肾脏的表达,并应用TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)干预,探讨TLR4对急性胰腺炎相关性肾损伤的影响,为急性胰腺炎肾损伤的防治提供理论依据。方法:1动物模型的制备:选取雄性wistar大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口进入腹腔,用4号加工钝头头皮静脉针头于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管,以0.2ml/min速度注入5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100g),推药后捏闭胰胆管入十二指肠处,观察3 min,剪除除结扎线,关腹。2实验分组:将雄性wistar大鼠18只,随机分为假手术组(SO组, n=6)、急性胰腺炎组(AP组, n=6)、TLR4单克隆抗体治疗组(TLR4mAb组, n=6) ,后者于造模后立即经腹腔注射TLR4mAb 50μg/只,于注药8小时处死大鼠,留取血液和组织血标本,进行相关项目的检测。3生化指标测定:取血清样本,采用全自动血清生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶、肌酐和尿素氮,由河北医科大学第二医院生化室协助测定。4胰腺、肾组织病理学:采用石蜡切片,HE染色。5免疫组织化学法测定肾组织TLR4、NF-kBp65表达:脱蜡至水,抗原热修复后,用3%过氧化氢孵育15 min。封闭一抗4°C过夜,阴性对照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15 min,后用3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色,复染后封片。以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性表达,并进行免疫组化评分。6 western blot法测定肾组织TLR4、NF-kBp65表达:取100mg肾组织经匀浆器彻底粉碎,加入1ml细胞裂解液,充分裂解,提取TLR4膜蛋白(具体操作按说明书),取20μg与上样缓冲液充分混合,置于SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至NC膜,以5%的脱脂奶粉封闭,一抗(1:250) 4°C孵育过夜,以相应的二抗室温下孵育2h,抗体检测按Santa Cruz公司试剂盒说明书进行。结果:1胰腺病理学:在SO组胰腺及周围组织结构始终大致正常;AP组胰腺及周围组织水肿、出血和坏死,伴有炎症细胞浸润,腹水也增多。而TLR4mAb组较AP组的损伤较轻。2肾脏病理学:在SO组肾组织结构始终大致正常;AP组肾组织水肿、充血,炎细胞聚集;而TLR4mAb组较AP组的肾组织结构损伤相对较轻。3血清淀粉酶、脂肪酶测定:在SO组正常。与SO组比较,在AP组及TLR4mAb组均显著升高(P<0.05)。与AP组比较,TLR4mAb组血清淀粉酶降低(P<0.05)。4血清肌酐、尿素氮变化:在SO组正常。与SO组比较,在AP组和TLR4mAb组均显著升高(P<0.05)。与AP组比较,TLR4mAb组血清肌酐、尿素氮降低(P<0.05)。5免疫组化法测定肾组织TLR4和NF-kBp65表达TLR4表达:在SO组肾组织TLR4有弱的表达。AP组,在血管内皮细胞,肾小管上皮细胞及肾间质均有明显增强的TLR4表达,免疫组化评分显示TLR4mAb组表达强度低于AP组(P <0.05)。NF-kBp65表达:在SO组肾组织NF-kBp65的表达量较少。在AP组肾小管上皮细胞及肾间质即见大量细胞核呈棕褐色染色的阳性细胞,在TLR4mAb组表达强度低于AP组(P <0.05)。6 western blot法测定肾组织TLR4和NF-kBp65 TLR4蛋白表达:密度扫描分析显示,在SO组肾组织有弱的TLR4表达,在AP组和TLR4mAb组均有明显增强(P <0.05)。与AP组比较,在TLR4mAb组表达减弱(P <0.05)。NF-kBp65蛋白表达:密度扫描分析显示,在SO组肾组织有弱的NF-kBp65表达。在AP组与TLR4mAb组NF-kBp65表达均明显增强(P <0.05)。与AP组比较,TLR4mAb组NF-kBp65表达减弱。结论:1对大鼠逆行胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠,检测血清淀粉酶、脂肪酶水平升高,血清肌酐、尿素氮升高,胰腺和肾组织HE染色观察到胰腺及肾周围组织水肿、出血和坏死,炎细胞浸润等表现,证实大鼠AP存在不同程度的肾损伤。2在AP大鼠肾组织中,TLR4和NF-κB表达均明显增加,TLR4作为炎症反应的闸门,可能与AP时肾损伤的发生发展有关。3应用TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)能改善大鼠AP相关性肾脏损伤。