【摘 要】
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D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体,具有高甜度、低能量、降血脂、降血糖等诸多优点,是理想的蔗糖替代品,在医药和食品等领域具有巨大的应用价值和市场前景。D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAEase）可以催化D-果糖发生C-3位置的差向异构化反应,是生物转化制备D-阿洛酮糖的关键酶制剂。然而,大多微生物来源的DAEase普遍被报道具有较低的热稳定性,难以适配工业应用需求。为推动DAEase的工业化应
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D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体,具有高甜度、低能量、降血脂、降血糖等诸多优点,是理想的蔗糖替代品,在医药和食品等领域具有巨大的应用价值和市场前景。D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAEase）可以催化D-果糖发生C-3位置的差向异构化反应,是生物转化制备D-阿洛酮糖的关键酶制剂。然而,大多微生物来源的DAEase普遍被报道具有较低的热稳定性,难以适配工业应用需求。为推动DAEase的工业化应用,本课题通过基因挖掘筛选出了来源于嗜热微生物Thermoclostridium caenicola的新型DAEase（Thca-DAEase）,并详细研究了Thca-DAEase的酶学性质及其生物合成D-阿洛酮糖的能力。同时开展了计算机辅助的理性改造研究,成功提高了Thca-DAEase的热稳定性。本课题的研究内容总结如下:（1）基于探针酶序列同源性搜索,结合酶蛋白序列的聚类分析和特征注释,筛选得到Thca-DAEase,其蛋白序列登录号为SHI77623.1,由289个氨基酸组成。合成编码该酶的基因并连接至表达载体p ET28a-Cred上,构建重组质粒。以E.coli BL21（DE3）为宿主生产目的酶,并进行Ni2+亲和层析纯化,SDS-PAGE检测和凝胶过滤色谱分析。结果显示目的酶正确表达,其亚基分子质量约为33 k Da,以同源二聚体的形式存在。（2）通过研究Thca-DAEase的最适条件,发现该酶的最适反应温度,最适p H和最适金属离子分别为65℃,p H 7.5和Co2+。Thca-DAEase需要金属离子存在才能表现出酶活力。在p H 6.5-8.0范围内,其酶活力受p H影响非常小,可以保持89.0%以上的相对酶活。动力学和热力学稳定性研究结果表明该酶在50℃条件下的半衰期(t1/2)为13.64h,解折叠温度（Tm）为62.42℃,Co2+孵育可以提高Thca-DAEase的热稳定性。（3）通过研究Thca-DAEase的底物特异性和反应动力学,发现以D-果糖为底物时,该酶的比酶活达到242.4±2.3 U/mg,动力学参数Km,kcat和kcat/Km分别为94.5±8.0 m M,204.5±0.4 s-1和2.2±0.2 m M-1 s-1,其对D-果糖的催化效率在同类酶中相对突出。研究利用Thca-DAEase生物合成D-阿洛酮糖,结果显示在p H 7.5条件下,以500 g/L的D-果糖为底物,反应5 h达到平衡,转化率为29.2%。在弱酸性条件下（p H 6.5）也能达到28.0%的平衡转化率。（4）基于蛋白质折叠自由能变化预测,理性选取突变“热点”,获得了四个热稳定性提高的单点突变体A70P、G107P、F155Y和D162T。其中最优单点突变体G107P的最适温度提高了5℃,Tm值提高了5.70℃,在60℃条件下的t1/2值是野生酶的40.6倍。有序叠加组合突变结果表明,四个正向单点突变对Thca-DAEase热稳定性的影响存在加和效应。其中四点组合突变体Var3的Tm值达到79.48℃,最适温度提高了10℃,在60℃下孵育24 h后仍能维持80%以上的残余酶活。分子动力学模拟和结构分析表明,突变体热稳定性提高可能与整体刚性变强、亚基间形成氢键以及表面电荷分布优化有关。
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