【摘 要】
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Pem cDNA编码一段210个氨基酸的多肽，其第116到175个氨基酸残基序列与同源异型域极为相似。Pem基因的表达具有明显的时间和空间特异性：在鼠胚发育的第6天，即可检测到Pem转录本的表达；第7-8天，Pem表达量达到最高，随后迅速减少；Pem基因在成年组织中一般不表达，但可在生殖组织表达；另外，Pem特异地在附睾近侧尾部和远侧的体部中表达，此处是精子获得运动性和受精能力的地方。这些资料表明
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Pem cDNA编码一段210个氨基酸的多肽，其第116到175个氨基酸残基序列与同源异型域极为相似。Pem基因的表达具有明显的时间和空间特异性：在鼠胚发育的第6天，即可检测到Pem转录本的表达；第7-8天，Pem表达量达到最高，随后迅速减少；Pem基因在成年组织中一般不表达，但可在生殖组织表达；另外，Pem特异地在附睾近侧尾部和远侧的体部中表达，此处是精子获得运动性和受精能力的地方。这些资料表明Pem可能在胚胎发育和精子形成过程中充当着重要的角色。 本实验室利用GAL4酵母双杂交系统对小鼠7天胚胎cDNA文库进行筛选，获到了几个与mPem蛋白相作用的分子，其中包括Cdc37和Mdfic。为进一步研究mPem蛋白的功能，及mPem蛋白与其它蛋白的相互作用，我们在大肠杆菌中高效表达并纯化重组mPem蛋白，制备其特异性多克隆抗血清。多克隆血清可直接用来检测mPem及其重组蛋白，进行一系列体外实验，研究Pem蛋白的功能。 目的：构建pET22b（+）-mPem原核表达质粒，在大肠杆菌中高效表达mPem-6His蛋白，纯化mPem-6His蛋白，制备其特异性多克隆抗血清。 方法：设计合适引物，通过PCR扩增mPem cDNA序列，将其克隆至原核表达载体pET22b（+），构建pET22b（+）-mPem表达质粒；表达质粒转化大肠杆菌表达菌株RossetaTM2（DE3），IPTG诱导表达mPem-6Hi s融合蛋白，并进一步优化IPTG诱导条件；Ni2+亲和层析纯化mPem-6His蛋白，并进行纯化蛋白的超滤除盐和冻干。以冻干后的mPem-BHis蛋白做为抗原，皮内注射免疫雄性新西兰兔制备mPem蛋白的特异性多克隆抗血清，ELISA测定其效价，Western blot检测其特异性。 结果：成功构建pET22b（+）-mPem原核表达质粒；实现Pem-6His蛋白在大肠杆菌中的高效表达，优化IPTG诱导条件，在转接后2.5-3.0h（0.D.600：0.6-1.0）加入0.4mM IPTG诱导1.5h，此时mPem-6His蛋白的表达量达到菌体总蛋白的16％；Ni2+亲和纯化了mPem-6His蛋白，并进行纯化蛋白的超滤除盐和冻干；制备了mPem蛋白的特异性多克隆抗血清，ELISA测定抗血清效价为1：160000，Western blot表明该多克隆抗血清能特异识别结合内源性及外源性Pem蛋白。 结论：构建了pET22b（+）-mPem原核表达质粒；实现了mPem-6His蛋白在大肠杆菌中的高效表达；进行了mPem-6His蛋白的纯化、除盐和冻干；制备了高效
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