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miRNA是在许多生物过程中都起着至关重要作用的内源性非编码的一类miRNA,他们与癌症、肿瘤等一些疾病的发生机制有关,现今也发现了很多在黑色素生成中都有重要调节作用的miRNA,根据本实验室所做的高通量测序结果即miR-146a在不同毛色羊驼皮肤内呈差异表达,有可能与黑色素生成相关,为了研究miR-146a对小鼠黑色素生成是否具有影响,本试验设计如下:利用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ将小鼠TYRP1基因的3’UTR区及其突变体和pmirGLO进行双酶切,并构建双荧光报告载体pmirGLO-miR-146a通过测定荧光素酶的活性来验证miR-146a的一个靶基因是酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)。通过运用小鼠黑色素细胞体外培养转染技术,并在小鼠黑色素细胞中过表达miR-146a mimic,再检测小鼠黑色素细胞中黑色素含量的变化趋势,采用荧光定量PCR和Western blot试验方法分别对转染的小鼠黑色素细胞中的酪氨酸酶(TYR),酪氨酸相关蛋白1(TYRP)及酪氨酸酸酶相关蛋白2(TYRP2)在mRNA水平和蛋白表达水平进行测定。主要实验结果如下:1.双荧光报告载体的构建,将pmirGLO-TYRP1 3’UTR与体外合成的miR-146a mimic共转染到293T细胞中,结果得出荧光素酶活性与对照组相比明显下降(P<0.01),则此结果表明TYRP1是miR-146a的靶基因。2.在小鼠黑色素细胞中转染miR-146amimic后,与对照组相比实验组黑色素细胞黑色素含量明显减少(P<0.01)3.采用实时荧光定量PCR检验技术检测miR-146a mRNA,TYR mRNA,TYRP1 mRNA,TYRP2mRNA表达量。其结果显示:在实验组中miR-146a mRNA的表达量很显著,TYR mRNA的表达量相对对照组降低了 0.808倍,TYRP1mRNA的表达量相对对照组相下降0.583倍,TYRP2 mRNA的表达量和对照组相比减少了 0.663倍(P<0.01)。4.Westem blot检测TYR,TYRP1,TYRP2的蛋白水平,与对照组相比分别降低0.443倍,0.468 倍和 0.705 倍(P<0.01)。上述研究结果表明,过表达miR-146a使小鼠黑色素细胞中TYR,TYRP1和TYRP2的表达量显著降低从而间接影响黑色素的生成。