目的:HBV(Hepatitis B virus)感染是导致急性及慢性肝病的主要原因之一。HBV感染宿主肝细胞后,病毒可以“劫持”多种宿主因子,帮助其完成自身的复制周期。本研究发现HBV的调节蛋白HBx可以抑制MDM2调控宿主解旋酶DHX9(DEAH(Asp-Glu-Ala-His)box helicase 9)的泛素化降解途径,上调DHX9蛋白水平;进一步发现DHX9可以促进病毒DNA的复制,并且依赖于其解旋酶活性和在细胞核中的定位。此外,DHX9对病毒DNA复制的调控依赖于其与Nup98(Nucleoporin 98)的相互作用。本研究揭示了 HBx调节宿主因子DHX9表达上调,促进HBV复制的机制。方法:(1)HBx调控DHX9表达上调的机制:Western blot检测HBV转基因小鼠肝脏样本及HBV复制的细胞模型中检测HBV感染后DHX9的表达变化,探究HBV复制对DHX9表达水平的影响。在HBV转染-复制细胞模型中,转染HBx蛋白表达质粒,研究HBx蛋白对DHX9表达的影响及机制。CHX(Cycloheximide)时间节点实验探究HBx对DHX9蛋白稳定性的影响;通过泛素化实验探索HBx调控DHX9的泛素化过程;Co-IP实验探究HBx与DHX9的相互作用。细胞模型中共转染HBx与MDM2质粒,探究HBx通过抑制MDM2通过泛素化体途径对DHX9的降解。(2)DHX9促进病毒复制的表型及功能研究:首先探索DHX9调控HB V复制的表型;在HB V转染-复制的人肝癌细胞模型中转染DHX9表达质粒,qPCR及Southern blot检测敲低和过表达DHX9后对HBVcore DNA水平的影响,用ELISA实验检测HBsAg水平及用qPCR实验检测HBV 3.5 KbRNA水平。用特异性干扰DHX9的siRNAs转入人肝癌细胞模型,验证DHX9对HBVcore DNA水平的影响。通过定点突变技术构建DHX9解旋酶活性突变体K417R及核定位缺失突变NLS,与HBV表达质粒共转染Huh7与HepG2-NTCP细胞,qPCR及Southern blot检测HBV复制水平的变化,探索DHX9解旋酶功能及细胞的核定位对病毒复制的影响。在HBV复制的肝癌细胞中利用siRNAs敲低Nup98或过表达Nup98质粒后,转染DHX9质粒,使用qPCR及Southern blot技术检测HBV DNA水平的变化,探究Nup98对DHX9促进HBV复制的影响。构建Nup98 498-920aa突变体,在Huh7与HepAD38细胞中共转染DHX9及HBV复制质粒,qPCR检测HBV复制水平的变化,探究DHX9促进病毒DNA是否依赖于DHX9与Nup98的相互作用。结果:(1)HBx调控DHX9表达上调的机制:DHX9蛋白水平在HBV转基因小鼠肝脏组织及HBV感染细胞模型中显著上调。进一步发现HBx能够上调DHX9的表达水平,这种上调作用发生在转录后水平。CHX蛋白稳定性试验表明,HBx可以延长DHX9的半衰期;泛素化实验表明HBx可以抑制DHX9的泛素化水平。Co-IP实验验证了 HBx与DHX9蛋白质之间发生相互结合,并且HBx可以抑制MDM2对DHX9的泛素化调控。(2)DHX9促进HBV复制的表型及机制研究:HBV复制的肝癌细胞模型中,过表达DHX9可以促进HBV的复制,但对HBsAg及HBV 3.5kb RNA水平并无明显影响;敲低DHX9可以抑制HBV的复制水平。DHX9促进HBV复制依赖于其解旋酶活性和在细胞核中的定位。Nup98可以调控DHX9对HBV的促进作用,并且依赖于Nup98与DHX9的相互作用。结论:HBV感染肝细胞后,通过上调宿主因子RNA解旋酶DHX9的表达,从而促进病毒复制。具体的分子机制是:HBx蛋白通过抑制MDM2介导的泛素化途径降解DHX9;表达上调的DHX9促进HBV复制,主要发生在DNA复制环节,这种促进病毒复制作用依赖于DHX9解旋酶活性和细胞核中的定位。Nup98与DHX9相互作用,促进DHX9调控HBV复制的效应。